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魯米諾是一類氨基鄰苯酰肼類物質，是最早在CLIA中使用的一種常見的化學發光物質。魯米諾在水溶液中的化學發光量子產率為1.0％～1.5％，最大發射光波長為425 nm，利用氨基與其他化合物連接。早期用魯米諾直接標記抗原或抗體，但當它標記到抗原或抗體分子上后，發光活性明顯降低，光子產率降為原來的10％，主要原因是標記后產生空間位阻。
制備原理：
3一硝基一鄰苯二甲酸(3-nitrophthalic acid)是制備化學發光劑魯米諾的原料，經脫水后得到的3一硝基一鄰苯二甲酸酐可用于有機合成和醇類測定。鄰苯二甲酸酐經直接硝化，既可獲得3一硝基一鄰苯二甲酸．同時也會得到4一硝基一鄰苯二甲酸。在3一硝基一鄰苯二甲酸分子中，硝基對鄰位羧基影響很大，它和羧酸會形成分子內氫鍵，加上相鄰二羧基之問存在的分子內氫鍵，對整個羧酸分子的解離產生顯著的抑制作用，從而導致其水溶性下降。在4一硝基一鄰苯二甲酸中，硝基與羧酸之間難以形成分子內氫鍵，因而，它在水中的解離度相對要大一些，水溶性也好一些。鄰苯二甲酸酐硝化后產生的異構體正是利用它們在水溶性上的差異加以分離的。其反應式如下：
許多化學反應都是以熱的形式釋放能量，也有一些化學反應主要是以光的形式釋放能量，魯米諾(1umino1)在堿性條件下與氧分子的作用就是一個典型的化學發光例子。一般認為，魯米諾在堿性溶液中轉變為二價負離子，后者與氧分子反應生成一種過氧化物，過氧化物不穩定而發生分解，導致形成一種具有發光性能的電子激發態中間體。其過程如下：
現已證實，發光體是3一氨基一鄰苯二甲酸鹽二價負離子的激發單線態。當激發單線態返回至基態時，就會產生熒光。激發態中間體也可將能量傳遞至激發態能量較低的受體分子，受激發的受體分子再通過發出熒光釋放能量恢復到基態。不同受體分子的激發態能量的差異使其發出的熒光各不相同，這些現象在本實驗中可觀察得到。
1．3一硝基一鄰苯二甲酸的合成
在100 mL三口燒瓶上，配置磁力攪拌器、溫度計、冷凝管和滴液漏斗，加12 mL濃硫酸和12 g鄰苯二甲酸酐。加熱并開動攪拌器，當反應混合物溫度升至80℃時停止加熱。將i0 mL發煙硝酸自滴液漏斗慢慢滴人燒瓶中，滴加速度以維持
反應混合物溫度在100～110℃為宜。
加完硝酸后，繼續加熱并攪拌l h，溫度控制在100℃。然后，讓反應液冷卻。在通風櫥中將反應液慢慢倒入盛有40 mL冷水的燒杯中。當有固體析出時，傾去酸液，再向燒杯中加入10 mL水，用玻璃棒充分攪拌，使副產物4一硝基一鄰苯二甲酸溶于水。過濾，收集固體，即得到3一硝基一鄰苯二甲酸粗產物。
3一硝基一鄰苯二甲酸粗產物可用水重結晶，在重結晶時，每克粗產物約需2．3 mL的水。產物熔點為215～218℃。
2．魯米諾的合成
將1．3 g 3-硝基一鄰苯二甲酸和2 mL lO％水合肼置于100 mL二口燒瓶中，加熱溶解。然后加入4 mL二縮三乙二醇，將二口燒瓶固定在鐵架臺上，加入沸石，插入溫度計，用一導管將燒瓶通過安全瓶與水泵相連。打開水泵，加熱燒瓶．瓶內反應物劇烈沸騰，蒸出的水蒸氣由導管抽走。大約5 min后，溫度快速升至200℃以上。繼續加熱，使反應溫度維持在210～220℃約2 min。打開安全瓶上的活塞，使反應體系與大氣相通，停止加熱和抽氣。讓反應物冷卻至100℃，加入20 mL熱水(加熱后再冷卻，所獲粗產物容易過濾)，進一步冷卻至室溫，過濾，收集淺黃色晶體，即得到5一硝基一鄰苯二甲酰肼中間體，中間體不需要干燥即可用于下一步的反應。
將5一硝基一鄰苯二甲酰肼中間體轉入燒杯中，加入6．5 mL lo％氫氧化鈉溶液。用玻璃棒攪拌使固體溶解。加人4 g二水合連二亞硫酸鈉，然后加熱至沸并不斷攪拌，保持沸騰5 min。稍冷卻，加入2．6 mL冰乙酸，繼而在冷水浴中冷卻至室溫．有大量淺黃色結晶析出。抽濾，水洗3次，再抽干，收集終產物5一硝基一鄰苯二甲酰肼(魯米諾)。取少許樣品，干燥后測定熔點(熔點為319～320℃)。
在250 mL錐形瓶中．依次加入15 g氫氧化鉀、25 mL二甲亞砜和0．2 g未經干燥的魯米諾，蓋上瓶塞，然后劇烈搖蕩，使溶液與空氣充分接觸。此時，在暗處就能觀察到從錐形瓶中發出的微弱藍色熒光。繼續搖蕩并不時地打開瓶塞，讓新鮮空氣進入瓶內，瓶中的熒光會變得越來越亮。
將不同熒光染料(1～5 mg)分別溶于2～3 mL水中，并加入魯米諾二甲亞砜溶液中，蓋上瓶塞，用力搖動。在暗室里可以觀察到不同顏色的熒光。部分結果見下表。
[1]李天星，陳建明，蒲曉允，趙樹銘主編，現代臨床醫學免疫學檢驗技術,軍事醫學科學出版社，2014.09，第18頁
[2] 何樹華，朱云云，陳貞干主編；田光輝，田春良，徐翠蓮等副主編，有機化學實驗，華中科技大學出版社，2012.08，第237頁