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γ-氨基丁酸,是一種白色或微黃色結晶狀粉末,吸濕性強,極易溶于水,微溶于熱乙醇,不溶于苯、冷乙醇、乙醚等有機溶劑,微臭,無旋光性,為極性物質,熔點為 203-205℃,相對分子質量為 103.12,分子式為 CHNO,γ-氨基丁酸的解離常數:pK= 4.03,pK= 10.56。γ-氨基丁酸在水溶液中通常以兩性離子形式存在,其解離情況主要取決于pH值的大小,等電點為 7.295。γ-氨基丁酸是一種非蛋白質氨基酸,具有氨基酸的某些特殊化學性質,能發生烴基化反應、酰基化反應、茚三酮顯色反應等。
(1)原料預處理過程:將茶葉作為原料進行清洗除雜脫酚,殺青烘干后粉碎備用;將鮮葉清洗并晾曬至含水量約 80%,分別將鮮葉在-18℃條件下處理16 h,然后用微波爐殺青 2-3 min(使用中高檔,每 30 s 翻勻一次),然后放入鼓風干燥箱中在 80 ℃下烘至絕干,粉碎過 80 目篩。或者將鮮葉清洗并晾曬至含水量約 80%,分別將鮮葉在-18℃條件下處理16 h,然后用微波爐殺青 2-3 min(使用中高檔,每 30 s 翻勻一次),然后放入鼓風干燥箱中在 80 ℃下烘至絕干,粉碎過 80 目篩。
(2)γ-氨基丁酸浸提過程:低頻超聲輔助堿提,制得γ-氨基丁酸提取液,具體過程為:稱取一定量茶粉置于錐形瓶中,按照液料比20:1 mL/g 加入一定量超純水后搖勻,在溫度為 50 ℃,功率為 220 W 條件下超聲浸提 30 min 冷卻后離心,抽濾,得到γ-氨基丁酸粗提液;
(3)γ-氨基丁酸濃縮過程:用旋轉蒸發儀將γ-氨基丁酸粗提液濃縮,加水配制成所需樣品液濃度。采用真空濃縮或者旋轉蒸發濃縮,真空濃縮溫度控制在40-60℃,濃縮至原體積的20-50%。旋轉蒸發濃縮時間為2h
(4)γ-氨基丁酸濃縮液的分離純化過程:可采用靜態吸附或者動態洗脫進行分離純化;中靜態吸附具體為:一定體積的樹脂,加入 95%乙醇浸泡 24 h,用水洗至無絮狀物且無乙醇味;然后用 4% NaOH 浸泡 5 h,用水洗至中性,再用 5% HCl 浸泡 8 h,用水洗至中性;動態吸附洗脫過程為:上樣流速 3mL/min,上樣濃度 0.2 mg/mL,洗脫液 pH=9,洗脫流速 2 mL/min。在此條件下,γ-氨基丁酸 的保留率為 80.06%,γ-氨基丁酸 的純度達到78.51%。
(5)γ-氨基丁酸干燥和保存的過程;向上述所得的γ-氨基丁酸沉淀中加入20~60倍沉淀重量的純凈水,室溫下洗滌6~8次,5000-11000r/min離心分離30min,得γ-氨基丁酸,加入5~15倍重量的純凈水,經攪拌調節pH至中性,再過膠體磨和均質機,噴霧干燥或冷凍干燥得γ-氨基丁酸產品。
通過此法得到的γ-氨基丁酸不僅純度高,原始營養物質也保存較為完整,適合大面積推廣。
一、菌體培養
乳酸菌菌種經活化后,進行一級種子培養,二級種子培養,最后進入發酵罐培養,接種量3%(V/V,種子液/發酵液), 30℃靜置培養16 h,發酵過程中通過補加堿液進行pH控制,使發酵液pH維持在4.5-7.0范圍內,通過0.6μm陶瓷膜過濾收集菌體。
種子培養基原料以g/L計:葡萄糖10,酵母膏 5,蛋白胨5,乙酸鈉0.5,磷酸氫二鈉(或磷酸氫二鉀)1,硫酸鎂1,硫酸錳1,PPE聚醚消泡劑0.1(但不僅限于此消泡劑,可選用任何可用于發酵工業的消泡劑)。
發酵培養基配方以g/L計:葡萄糖10,酵母膏 5,蛋白胨5,乙酸鈉0.5,谷氨酸鈉1,磷酸氫二鈉(或磷酸氫二鉀)1,硫酸鎂1,硫酸錳1,PPE聚醚消泡劑0.1(但不僅限于此消泡劑,可選用任何可用于發酵工業的消泡劑)。
二、生產γ-氨基丁酸
采用乳酸菌細胞轉化法生產γ-氨基丁酸,反應條件為:配制0.01mol/L pH7的醋酸-醋酸鈉緩沖液,加入20g/L菌體細胞,分批加入底物谷氨酸鈉,初始底物濃度10g/L,每4h添加一次底物,添加濃度為5g/L,總反應底物濃度為25g/L,反應溫度為28℃,發酵時間為17h。結束后,通過離心收集清液,得到含量達12g/L的γ-氨基丁酸轉化液,見圖1。
三、 γ-氨基丁酸含量的檢測
將上述轉化液離心后加入等體積100g/L的三氯乙酸,振蕩均勻,再離心(10,000×g,5 min),清液稀釋2-10倍,再經0.45 μm膜過濾,進行高效液相分析。采用ODS C18(φ4.6×250nm),40℃分析,γ-氨基丁酸用外標法定量。
四、產品制備:
過濾除菌:將得到的γ-氨基丁酸轉化液經金屬微米膜過濾器進一步除去菌體細胞,得到清液;
脫色:將過濾除菌后得到的清液pH調至7.0-8.0,然后通過顆粒活性炭柱進行脫色處理,收集清液;
電滲析:采用電滲析去除雜質,控制料液pH為7.0-8.0,在電導率下降至≤1000μs/cm時,停止循環,收集γ-氨基丁酸清液;
將步驟(4)得到的γ-氨基丁酸清液,制成γ-氨基丁酸粉劑產品或γ-氨基丁酸晶體產品。
所述制成γ-氨基丁酸粉劑產品的方法依次包括下列步驟:
(a)真空濃縮:采用三效板式蒸發器進行濃縮,待料液濃縮至γ-氨基丁酸含量為≥50g/L時,停止濃縮;
(b)噴霧干燥:濃縮液中添加麥芽糊精或淀粉,調節固形物質量含量為5-50%,進行噴霧干燥,制得質量含量為20-50%的γ-氨基丁酸粉劑產品;
所述制成γ-氨基丁酸粉劑產品的方法依次包括下列步驟:
(a)真空濃縮:采用三效板式蒸發器進行濃縮,待料液濃縮至γ-氨基丁酸含量為≥80g/L時,停止濃縮,收集濃縮液;
(b)噴霧干燥:在濃縮液中添加麥芽糊精或淀粉,調節固形物質量含量為5-50%,進行噴霧干燥,制得質量含量為20-50%的γ-氨基丁酸粉劑產品。
所述制成γ-氨基丁酸晶體產品的方法是:將步驟(6)得到的γ-氨基丁酸清液,經過離子交換樹脂處理;然后將料液pH調至γ-氨基丁酸等電點,通過降溫結晶,得到純度達到98%的γ-氨基丁酸晶體產品。
[1] [中國發明] CN201811219488.1 一種茶葉中γ-氨基丁酸提取純化工藝
[2] [中國發明,中國發明授權] CN201210304596.5 生物法制備γ-氨基丁酸的方法