7365-45-9 / hepes緩沖液的應用

概述^[1]

hepes緩沖液的主要成分是羥乙基哌嗪乙硫磺酸（2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid），HEPES是一種非離子兩性緩沖液,其在pH 7.2 - 7.4 范圍內具有較好的緩沖能力。其最大優點是在開放式培養或細胞觀察時能維持較恒定的PH值.在這種培養條件下,細胞培養瓶的蓋子應擰緊,以防止培養液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。

大多數培養液中含有酚紅作為pH指示劑,酸性培養液呈橙黃色,堿性培養液呈深紅色.HEPES有些昂貴,在高濃度時對一些細胞可能有毒. 原則上,hepes緩沖液可用來代替碳酸氫鹽，以解除需要高濃度CO2培養環境的限制.實際操作中并非如此簡單。溶解的CO2與碳酸氫鹽對良好的細胞生長也是很重要的。

hepes緩沖液使用方法有兩種：

(1)hepes緩沖液可按所需的濃度直接加入到配制的培養液中,再過濾除菌.每1000ml培養液中加入2.38克HEPES,待溶后用lN NaOH 調pH至7.2,濾過除菌后使用.此時HEPES的使用濃度為10 mmol/L.

(2)亦可配成 100 x 貯存液（l mol/L），使用前取 99ml培養液加入 lml貯存液，最終應用濃度仍為10mmol/L。l mol/L（100 x）hepes緩沖液配制方法:取23.8g HEPES溶于90ml雙蒸水中,用lN NaOH調pH至7.5一8.0,然后用水定容至100ml,過濾除菌,分裝小瓶（2ml/瓶）,4℃或-20℃保存.

羥乙基哌嗪乙硫磺酸

應用^[3]

1.促進脫礦牙本質再礦化的方法，包括以下步驟：

（1）將133mmol/L NaCl溶液加入到50 mmol/L乳酸溶液中，直至乳酸溶液的pH值為4，得 到配置好的乳酸溶液；將2mm×2mm×12mm大小的EBPM-NACP樹脂條放置于50mL配置好的乳 酸溶液中，共放置42天；其中于第7、14、21、28、35、42天分別測量該乳酸溶液中的Ca、P離子 濃度，得到其初次釋放曲線，即圖1-2；隨后，樹脂條再置于100mL上述配制的乳酸溶液中30 天，使其樹脂條中的Ca、P離子徹底釋放；

（2）將步驟（1）中得到的樹脂條浸泡于5mL CaCl2和HEPES緩沖液構成的pH值為7的溶液 中，其中CaCl2終濃度為100mmol/L，HEPES終濃度為50mmol/L，震蕩1min，用去離子水沖洗樹 脂條并于空氣中干燥；對EBPM-NACP樹脂條進行鈣離子“充電”；

（3）將步驟（2）中得到的樹脂條浸泡于5mL K2HPO4和hepes緩沖液構成的pH值為7的溶 液中，其中K2HPO4終濃度為60mmol/L，HEPES終濃度為50mmol/L，震蕩1min，用去離子水沖洗 樹脂條并于空氣中干燥；對EBPM-NACP樹脂條進行磷離子“充電”；

（4）重復步驟（2）和（3）三次，將樹脂條沖洗1min并在空氣中干燥；

（5）將步驟（4）處理得到的樹脂條放置脫礦牙本質樣本上，并置于模擬口腔環境中。

進一步的，步驟（5）處理之前還包括以下步驟：將脫礦牙本質樣本用濃度為1mg/mL 的端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物溶液浸泡處理1h；端基為氨基的聚酰胺-胺型樹 枝狀聚合物采用第三代端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物，簡稱PAMAM；常溫、常壓下 將10mgPAMAM粉末溶于10ml去離子水中得到1mg/mL的PAMAM溶液；第三代端基為氨基的聚酰 胺-胺型樹枝狀聚合物是以乙二胺為起始核心，反復與丙烯酸甲酯通過Michael加成反應后 再與乙二胺通過酰胺化反應制備而成的。

2.制備納米金顆粒

步驟S1：配制濃度為0.05-10mmol/L的氯金酸溶液；

步驟S2：配制濃度為5-50mmol/L的hepes緩沖液，并用氫氧化鈉調節hepes緩沖液的PH值至7.0-8.0；

步驟S3：向步驟S2所配制的HEPES緩沖液中添加表面活性劑，配制濃度為1-2mmol/L的表面活性劑溶液；

步驟S4：將步驟S3所配制的表面活性劑溶液引入反應池，按氯金酸溶液和表面活性劑溶液的摩爾比為1:1-1:10向反應池中緩慢添加步驟S1所配制的氯金酸溶液，并以200-300r/min的速度勻速攪拌，反應5-30min，獲得含有納米金膠體的混合液；

步驟S5：將步驟S4所配制的混合液進行納米金膠體的干燥提純，獲得納米金顆粒。

以配制200L的濃度為50mmol/L的hepes緩沖液為例，其配置方法為：首先稱取2.38kg的HEPES溶于180L的去離子水中，超聲、振蕩直至完全溶解；然后使用PH計測得此時溶液的PH值約為5.4，于是慢慢添加0.1mol/L的氫氧化鈉溶液并不斷攪拌直至PH調整至7.4；最后繼續添加去離子至200L。

制備^[2]

方法1:

直接使用1,2-二氯乙烷作為溶劑，在裝有機械攪拌、溫度計的100mL的三口瓶中加入羥乙基哌嗪（5.00g,0.02mol)，碳酸鉀K2CO3（6.00g，0.04mol），50mL1,2-二氯乙烷，油浴加熱90℃（1,2-二氯乙烷沸點85℃），攪拌反應20h。停反應，過濾，用200mL乙酸乙酯（EA）洗滌濾出的鹽。濾液旋干，得2.6gHEPES固體。

方法二：

在裝有磁力攪拌器、回流冷凝管的三口瓶中依次加入11.0g(84.5mmol)無水亞硫酸鈉、27.0mL（343.6mmol)二氯乙烷、120mL水、110mL乙醇，50mg銅粉，攪拌，油浴加熱升溫到回流。回流22h后，將反應液減壓蒸除水，至白色固體全部析出。此固體主要由產物、未反應的原料和生成的鹽組成。將所得固體及500mL乙醇加入1L燒瓶中，加熱回流40min。趁熱抽濾，濾液冷卻后，0℃放置過夜。抽濾，真空干燥，得片狀結晶，產量11.40g，收率81.0％。

在裝有磁力攪拌器、回流冷凝管、溫度計的四口瓶中依次加入氯乙磺酸鈉（15.10g，0.08mol），羥乙基哌嗪（9.88g，0.075mol），60mL水，油浴105℃攪拌反應，隨著反應進行，反應液的pH會下降，滴加5mol/LNaOH水溶液，控制pH在9左右，共計加入15mL，再繼續反應5h。

反應結束，將反應液加水稀釋到500mL，上離子交換樹脂柱（約500g）進行去鹽純化，反應液全部上柱之后，用蒸餾水沖至流出液pH為6，再用1mol/L氨水淋洗，收集TLC檢測有產物點的流出液（pH約5~9）。旋蒸濃縮至150mL，加入活性炭脫色，油浴110℃，加熱攪拌0.5h，過濾，旋干濾液，加入50mL乙醇，加熱回流0.5h，熱過濾，所得白色固體干燥后為8.63g。濾液滴加冰醋酸，調pH到5，0℃冷卻過夜，過濾，所得固體干燥后為2.80g。與前述HEPES固體共計11.43g，收率64.5%。

10mmol/L hepes緩沖液配制方法如下：準確稱取HEPES 2.383g，加入新鮮三蒸水定容至1L。過濾除菌，分裝后4℃保存。如果用于加入細胞培養液中作緩沖劑，建議培養液避光保存。

主要參考資料

[1]曾琦斐. (2010). 表面活性劑存在下hepes緩沖溶液中制備納米金顆粒. 武漢工程大學學報, 32(7), 39-42.

[2] 繆驥, 馬鋒, 劉學民, 向俊西, 董鼎輝, & 呂毅. (2015). 低滲hepes緩沖溶液對腹腔內游離肝癌細胞殺傷作用的實驗研究. 中國普外基礎與臨床雜志(1), 55-59.

[3] Morgia F, Torti M, Montigiani M, M. Sbracia, & 朱亮. (2006). 卵母細胞單精子顯微注射過程中使用含有羥乙基哌嗪乙磺酸(hepes)的緩沖液對體外受精的結局有害. 世界核心醫學期刊文摘:婦產科學分冊(11), 31-32.