10597-60-1 / 羥基酪醇的制備及藥理作用

背景及概述^[1][2]

羥基酪醇( hydroxytyrosol，HT)是一種存在于油橄欖(Olea europaea L．) 植物中的多酚類化合物， 可從橄欖油、加工橄欖油廢水以及橄欖葉中分離得到。前期諸多研究表明: 羥基酪醇清除自由基能力強，表現(xiàn)出獨特的生物活性，如抗氧化、抗菌、抗炎、改善心臟的冠脈血流等， 而且還能抑制人類早幼細胞白血病細胞HL60、腺癌細胞 HT29 及 HT29 克隆體 19A、女性乳腺癌 MCF-7 細胞等擴散，通過阻滯腫瘤細胞的循環(huán)及誘發(fā)其凋亡，得到很好的抗癌活性。近年發(fā)現(xiàn)，羥基酪醇能夠與 gp41 蛋白結(jié)合，阻斷人免疫缺陷病毒(HIV) 進入宿主細胞， 或可用于艾滋病的防治。該化合物無明顯毒性反應(yīng)，其在醫(yī)藥、食品和化妝品行業(yè)的應(yīng)用前景近年受到廣泛關(guān)注。

熱穩(wěn)定性^[1]

利用熱重分析儀對羥基酪醇熱失重過程進行記錄，圖1為升溫速率10 K /min 的 TG-DTG 曲線。從圖 1 可看出，羥基酪醇的分解一步完成，260℃以前為穩(wěn)定階段，TG 曲線和 DTG 曲線一直都平滑無降低，說明在此之前羥基酪醇一直處于穩(wěn)定狀態(tài)而未分解。260℃ 之后，羥基酪醇開始劇烈分解，TG 曲線隨著溫度升高而迅速出現(xiàn)陡峭明顯的失重臺階，DTG 曲線出現(xiàn)負值，且隨著溫度升高而急劇下降，在 305.2℃達到了DTG 的峰值，此時最大熱失重速率為-12.91% /min。由圖可以看出熱分解在260～409℃ 為羥基酪醇主要失重階段，其分解作用基本完成；在409～900 ℃為緩慢失重過程，且由羥基酪醇的 TG曲線可知此時其殘留質(zhì)量為2.68%。而 TG-DTG 曲線在409～900℃ 的升溫過程中一直呈平滑曲線，說明此時的羥基酪醇已經(jīng)分解完成。因此要保持羥基酪醇不分解，應(yīng)保證外界溫度不能超過260℃。

表 1 列出了不同升溫速率下羥基酪醇熱解特性參數(shù)， 同時也可看出升溫速率的變化對羥基酪醇的分解有影響。隨著升溫速率提高，熱失重的起始溫度( t_b) 、 終止溫度(t_e) 和最大熱失重速率溫度(t_m)均向高溫區(qū)移動，且熱分解程度也加劇。對羥基酪醇的T_m ( T_m = t_m + 273.15) 和不同β的變化情況進行線性擬合，可得到相關(guān)關(guān)系式。羥基酪醇最大熱失重速率溫度和升溫速率的的關(guān)系式 T_m = 1.3657β+ 560.87，相關(guān)系數(shù) R² =0. 9818。可見T_m 與β有很好的線性關(guān)系，且羥基酪醇在β= 0 K /min、N₂氣氛中的平衡熱分解溫度為560. 87 K。

制備^[2]

羥基酪醇可通過酶或酸催化水解，從生產(chǎn)橄欖油的廢料中提取得到，也可經(jīng)化學(xué)合成制備，但規(guī)?；a(chǎn)的方法尚不成熟。在化學(xué)合成方面，迄今報道的合成方法多是在實驗室條件下完成的，例如，通過還原 3，4-二羥基苯乙酸可得到羥基酪醇，也可采用生物催化或化學(xué)方法將酪醇或苯乙醇轉(zhuǎn)化為羥基酪醇， 但受到原料及反應(yīng)條件的限制，僅適于實驗室少量制作。羥基酪醇的經(jīng)濟、簡便制備方法，目前仍是多方研究的課題。鄰苯二酚價廉易得，是較好的合成原料，帝斯曼公司報道以鄰苯二酚、乙醛酸為原料合成羥基酪醇的專利方法，二者在堿性條件下反應(yīng)得到 3，4-二羥基扁桃酸，經(jīng)高壓催化氫化脫除羥基，再還原羧基得到羥基酪醇。此法步驟短，較適合進行工業(yè)生產(chǎn)，但脫除3，4-二羥基扁桃酸 α-羥基的反應(yīng)，需在強酸和高壓下完成，對設(shè)備要求較高，且收率較低。筆者嘗試用亞硫酸氫鈉或焦亞硫酸鈉脫除3，4-二羥基扁桃酸的α-羥基，在較溫和的條件下即可得到目標產(chǎn)物，二者效果相近。改進后的合成方法所用試劑價廉易得，反應(yīng)條件簡單易行，有利于羥基酪醇的規(guī)模化制備。

羥基酪醇的合成步驟如圖 1 所示。鄰苯二酚與乙醛酸在堿性環(huán)境和 Al₂O₃催化下縮合得到 3，4-二羥基扁桃酸(1) 。反應(yīng)完成后體系中存在乙醛酸在堿性條件下發(fā)生歧化反應(yīng)產(chǎn)生的雜質(zhì)和未反應(yīng)的鄰苯二酚。文獻中后處理方法是用有機溶劑萃取后，以飽和氯化銨洗滌有機相。該方法洗滌時易析出氯化銨固體，且有機相中也殘留有氯化銨，影響實驗操作和產(chǎn)物純度。因此改用分級萃取的方法，首先用鹽酸調(diào)溶液 pH 至 3～ 4，用乙酸乙酯萃取出未反應(yīng)的鄰苯二酚，而 3，4-二羥基扁桃酸仍在水層中；然后調(diào) pH 至略小于 2，此時 3，4-二羥基扁桃酸易溶入有機相而被萃取出來， 蒸干后用乙醚洗滌可以得到較純的產(chǎn)物。脫除 3，4-二羥基扁桃酸 α-羥基的現(xiàn)有方法， 是在高濃度鹽酸和 Pd/C 催化下進行高壓氫化，對設(shè)備要求苛刻， 實用性較差。經(jīng)實驗，將 3，4-二羥基扁桃酸在甲酸存在下與亞硫酸氫鈉或焦亞硫酸鈉反應(yīng)，可脫除其α-羥基，得到3，4-二羥基苯乙酸(2)，兩種試劑的脫羥基效果相近。升高浴溫、延長反應(yīng)時間可提高反應(yīng)的產(chǎn)率。3，4-二羥基苯乙酸可直接還原得到羥基酪醇，但需要較強烈的還原反應(yīng)條件。由于羥基酪醇溫度過高時不穩(wěn)定，因此本研究中首先將 3，4-二羥基苯乙酸甲酯(3) 化，再用LiAlH₄ 在 40℃將其還原成羥基酪醇(4)，兩步反應(yīng)總收率 85% 。

藥理作用^[3]

1 抗癌作用研究

HT 能抑制腫瘤發(fā)生的多個階段且具有廣譜性。首先，HT 能保護細胞內(nèi) DNA 和酶免受 ROS 與自由基的破壞以預(yù)防癌癥的發(fā)生。與其酯化物橄欖苦苷相比，HT 具有更強的抗氧化應(yīng)激作用，Ilavarsi 等證實在外周血單核細胞中 HT 降低了二噁英誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和 DNA 破壞，它通過降低過氧化脂質(zhì)、 ROS 的量和增加抗氧化酶的活性，抑制細胞內(nèi) DNA 被破壞，并減少細胞形態(tài)學(xué)的變化。另外，HT 在較低濃度下即能抑制丙二醛、H₂O₂脂肪酸和7-酮基膽固醇的生成，并能有效地阻斷 ERK 和 Akt /Pkb 的磷酸化狀態(tài)發(fā)生改變，還能抑制外來因素(如紫外線 B、苯胼芘等) 所導(dǎo)致的 DNA 破壞。其次，HT 能抑制癌細胞增殖與促進其凋亡來發(fā)揮抗癌作用。

2 抗血栓、調(diào)血脂和抗動脈硬化作用研究

研究發(fā)現(xiàn)食用橄欖油能大大降低心血管疾病的發(fā)病率，其中 HT 發(fā)揮了重要的作用。有研究指出，HT 抗心血管疾病的作用與抑制血小板凝集密切相關(guān)，González-Correa 等以水楊酸作參比考察了 HT 對大鼠體外血的抗凝集作用，實驗結(jié)果證明它能抑制血栓素 B 的合成，并能提高氧化亞氮的生成量，從而達到抗凝作用。de Roos 等則以人血細胞為研究對象考察了 HT 的抗凝集作用，當濃度為 100 mg/L 時，蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明它參與調(diào)節(jié) 9 種蛋白發(fā)揮抗凝集作用，如血小板結(jié)構(gòu)、活性和整合素 aIIb/b3 的轉(zhuǎn)導(dǎo)等。由結(jié)果可知，HT 能抑制血小板的活性和粘連，可用于預(yù)防血栓的形成。

3 抗病原微生物作用研究

HT 可能開發(fā)成一種治療腸道和呼吸道感染的藥物，它具有高效和廣譜的特點。以幽門螺旋桿菌為例，其在世界范圍內(nèi)存在多種耐抗生素的菌株，但是 HT對耐藥和非耐藥菌株均具有強力的殺傷作用。另有研究 HT 對 5 種標準菌株( ATCC 9006、ATCC 8176、ATCC 6539、ATCC 17802、ATCC 25923) 和臨床上得到的 44 種菌株最低抑菌濃度分別為0．24～7．85 μg /mL、0．97～31．25 μg /mL，抑菌濃度明顯低于其他植物提取物，而且對抑制革蘭陽性菌的活性高于革蘭陰性菌。值得注意的是，其抗菌活性不僅表現(xiàn)在腸道內(nèi)有害菌種方面， 還 對嗜乳酸菌和雙歧桿菌具有抑制作用。

主要參考資料

[1]原姣姣,葉建中,王成章,劉玉紅.羥基酪醇的熱穩(wěn)定性和分解動力學(xué)研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2016,36(06):87-92.

[2]肖艷,張楊,楊郁,任鳳霞,崔廣智,趙毅民.羥基酪醇的合成方法[J].國際藥學(xué)研究雜志,2013,40(03):335-337.

[3]劉威振,張興,陳新建,譚毓治.羥基酪醇藥理作用研究進展[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報,2012,28(06):684-688.