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10-甲酰葉酸是一種葉酸衍生物。葉酸是一種具有重要營養價值的水溶性B族維生素，是指四氫葉酸及其衍生物這一類物質，它由蝶啶、對氨基苯甲酸和谷酰基鏈組成。作為一碳供體，葉酸參與嘌呤、嘧啶的合成和氨基酸的相互轉化。人體缺少葉酸會導致一系列的慢性疾病，例如神經管缺陷、先天缺陷、巨紅血球性貧血、心血管疾病和癌癥等。
CN201510527402.1報道了一種快速高靈敏同步定量檢測蔬菜中總葉酸及其衍生物含量的方法，依次包括以下步驟：
1)、提取植物葉片中的葉酸及葉酸衍生物：
利用0.05M磷酸緩沖液煮沸提取植物葉片的葉酸，冷卻并離心后，得上清液，上清液為葉酸提取物(包括葉酸及葉酸衍生物)；
2)、添加兩種葉酸軛合酶
往步驟1)中的葉酸提取物添加老鼠血清軛合酶和雞胰腺軛合酶，加入氬氣后37℃孵育2小時，100℃水浴5分鐘終止酶活，離心后取上清液，上清液為葉酸去軛合提取物；
3)、使用超濾離心管純化植物葉片葉酸去軛合提取物
使用10kDa500μL超濾離心管(Millipore，美國)，活化后，往里加入500μL步驟2)得的葉酸去軛合提取物，12000g4℃離心15分鐘，得到純化后的葉酸純化液(為過柱后所得的溶液)；
4)、超高效液相色譜質譜聯用分離葉酸衍生物質譜方法
超高效液相色譜質譜聯用檢測系統為四極桿串聯質譜(WatersXevoTQ-S,Waters,美國)常壓電噴霧電離(ESI)正極模式。WatersIntelliStartTechnology通過自動和手動優化所有葉酸衍生物的多離子反應監測(multiplereactionmonitoring,MRM)。每一種葉酸衍生物使用兩個或三個子離子確定，結果如表1。MassLynx4.1(Waters,美國)軟件用于系統運行、數據采集和數據分析。表1葉酸及葉酸衍生物的多離子反應檢測和化合物指標
5)、超高效液相色譜質譜聯用分離葉酸衍生物色譜方法
使用WatersACQUITYUPLC系統(Waters，美國)進行葉酸衍生物的色譜分離，運行軟件為TargetLynx4.1(Waters，美國)。柱溫箱維持40℃，自動進樣器維持4℃。色譜柱是ACQUITYUPLCBEH,C18column，規格為2.1mm×50mm，粒徑1.7μm(Waters，美國)連接一個VanGuard前置柱C18，規格為5mm×2.1mm，粒徑1.8μm(Waters，美國)。流速0.4mL/min；進樣量2μL，運行時間5分鐘。流動相為洗脫液A(0.1％甲酸溶于水)和洗脫液B(0.1％甲酸溶于乙腈)梯度洗脫，詳見表2。針頭清洗溶劑為乙腈/水混合液(50/50,v/v)；表2UPLC-MS/MS最佳梯度洗脫
6)、植物葉片葉酸衍生物的定量測定。
作為本發明高效高靈敏同步定量檢測植物葉片總葉酸及其衍生物的方法的改進：步驟1)中的0.05M磷酸緩沖液濃度為每升加入10gL(+)-抗壞血酸和10ml二巰基丙醇的磷酸緩沖液。
作為本發明高效高靈敏同步定量測量植物葉片總葉酸及其衍生物的方法的進一步改進：所述步驟2)中在每10mL葉酸提取物中加入2mL雞胰腺軛合酶，搖勻后，吸取3mL溶液于50mL離心管中，加入100μL老鼠血清軛合酶，搖勻，充入氬氣，37℃孵育2小時，100℃水浴5分鐘終止酶活。
作為本發明高效高靈敏同步定量檢測植物葉片總葉酸及其衍生物的方法的進一步改進：所述步驟6)為：根據步驟4)和步驟5)的條件，對植物葉片葉酸及其衍生物進行定量測定，記錄主峰峰面積，按照外標法以峰面積自動計算得出四氫葉酸、5-甲基-四氫葉酸、5-甲酰-四氫葉酸、5,10-次甲基四氫葉酸、10-甲酰葉酸、10-甲酰-四氫葉酸、葉酸的含量，再根據四氫葉酸、5-甲基-四氫葉酸、5-甲酰-四氫葉酸、5,10-次甲基四氫葉酸、10-甲酰葉酸、10-甲酰-四氫葉酸、葉酸的濃度和相對分子質量計算總葉酸含量。
[1][中國發明,中國發明授權]CN201510527402.1快速高靈敏同步定量檢測葉片總葉酸及葉酸衍生物的方法