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羥基積雪草酸是積雪草中有效活性成分，研究表明其具有抗氧化、抗抑郁、抗菌、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理活性功能，尤其是對(duì)腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用。
1. 將積雪草粉碎,用60-70v%乙醇溶液川流提取,將提取液過(guò)濾,濾液回收溶劑，再加40-50C水溶解,過(guò)濾,將濾渣溶于50-60v%乙醇溶液,得到粗提液。
2. 將粗提液上XAD-9人孔樹(shù)脂柱,用pH值為2-4的酸液洗脫,合并流川液和酸洗液。
3. 調(diào)節(jié)合并液pH值至中性,過(guò)濾,將濾液再次EXAD-3大孔樹(shù)脂柱,用體積濃度為30-40%的乙醇洗脫,薄層層析跟蹤檢測(cè),收集含有積雪草酸成分的乙醇洗脫液;再刃體積濃，度為55-65%的乙醇洗脫，薄層，層析跟蹤檢測(cè),收集含羥基積雪草酸的乙醇洗脫液,將羥基積雪草酸洗脫液回收乙醇,干燥,得到羥基積雪草酸。
步驟1中，體積濃度為60-70%的乙醇可充分溶解積雪草中的二萜類物質(zhì)，包括三萜炎皂節(jié)和三萜酸炎物質(zhì)。由于積雪草皂并的分子中往往結(jié)合有多數(shù)糖分子,羥基數(shù)日多,能表現(xiàn)出一定的親水性，但足親水性不強(qiáng),微溶于水中，而二萜酸類極性較小，不能溶于水中。因此采用40-50℃溫水可幫助積雪草總皂節(jié)溶解,積雪卓三惦酸類物質(zhì)不溶于熱水中，將濾液過(guò)濾,取濾渣溶于乙醇，達(dá)到去除積雪草總皂苷的日的。
XAD-9樹(shù)脂主耍吸附的是脂溶性成分，大分子極性強(qiáng)的物質(zhì)，這些物質(zhì)對(duì)樹(shù)脂的吸附性更強(qiáng)，大孔樹(shù)脂優(yōu)先吸附這些物質(zhì)而很快達(dá)到飽和。XAD-9是極性大孔樹(shù)脂，與三萜酸類極性相差較大，無(wú)法有效吸附三萜酸類化合物，XAD-9樹(shù)脂平均孔徑較大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于三萜酸類化合物，也無(wú)法起到物理截留三萜酸類化合物的作用，因此，三萜酸類化合物會(huì)隨著流出液流出。pH值為2-4的酸液洗脫可進(jìn)一步將樹(shù)脂中吸附的少量三萜酸類化合物洗脫下來(lái),避免三萜酸類化合物的吸附損失。
步驟2中,粗提液上柱速度為3-5BV/h。酸液的洗脫速度為1-2BV/h。
步驟3中，XAD-3型號(hào)大孔樹(shù)脂為非極性樹(shù)脂，平均孔徑為0.44um，比表面積256m2/g。該樹(shù)脂對(duì)三萜酸類化合物有很有的吸附性能，濾液的上柱速度為0.5-1BV/h,可將二帖酸炎化合物吸附完全。由于積雪草酸和羥基積雪草酸存在極性差異，采用體積濃度為30-40%的乙醇洗脫，可優(yōu)先洗脫積雪草酸。然后用體積濃度為55-65%的乙醇洗脫，可將剩下的羥基積雪草酸洗脫卜來(lái)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比,本方法針對(duì)目標(biāo)成分進(jìn)行吸附和解吸附，提取的羥基積雪草酸收率高達(dá)90%以上，純度高達(dá)95.0%以上。
1. 將積雪草粉碎，用60v%乙醇溶液回流提取,60v%乙醇的用量為積雪草重量的5倍，在40°C下回流提取1次，每次0.5h，將提取液過(guò)濾,濾液回收溶劑，再加40°C水溶解，過(guò)濾，將濾渣溶于50v%乙醇溶液，得到粗提液。
2. 將粗提液上XAD-9大孔樹(shù)脂柱,粗提液上柱速度為3BV/h，用pH值為2的酸液洗脫，酸液的洗脫速度為1BV/h，合并流出液和酸洗液。
3. 調(diào)節(jié)合并液pH值至中性，過(guò)濾，將濾液再次上XAD-3大孔樹(shù)脂柱，濾液的上柱速度為為0.5BV/h，用體積濃度為30%的乙醇洗脫，乙醇洗脫述度為2BV/h，薄層層析跟蹤檢測(cè)，收集含有積雪草酸成分的乙醇洗脫液。再用體積濃度為55%的乙醇洗脫，乙醇洗脫速度為2BV/h薄層層析跟蹤檢測(cè)，收集含羥基積雪草酸的乙醇洗脫液，將羥基積雪草酸洗脫液回收乙醇，干燥，得到羥基積雪草酸。
經(jīng)HLPC分析,羥基積雪草酸的回收率為90.08%以上,純度高達(dá)95.27%。
采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)積雪草中的活性物質(zhì)進(jìn)行分離檢測(cè)研究，但羥基積雪草酸和terminolic acid 在一般的HPLC條件下，無(wú)論以恒比例洗脫或梯度洗脫均顯示單一的色譜峰，無(wú)法得到理想的分離度。采用β-環(huán)糊精(β-CD)為流動(dòng)相添加劑對(duì)它們進(jìn)行了分離，并對(duì)分離后的物質(zhì)進(jìn)行了簡(jiǎn)單的確證?？疾炝瞬煌瑵舛鹊?beta;-環(huán)糊精和不同流動(dòng)相pH對(duì)其分離度的影響，建立了積雪草樣品中羥基積雪草酸含最的測(cè)定方法。
精密稱取50%積雪草總苷元適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成50%積雪草總苷元甲醇溶液5.58 g/L 備用。進(jìn)樣前用0.45 um微孔濾膜過(guò)濾。
將50%積雪草總苷元溶液重復(fù)進(jìn)樣，在HPLC檢測(cè)器的出口處分段收集羥基積雪草酸和terminolic acid各約40 mL。將收集到的洗脫液蒸干后，利用β-環(huán)糊精在甲醇中溶解度小而羥基積雪草酸和terminolic acid在甲醇中溶解度大的差異，去除β-環(huán)糊精,進(jìn)樣，進(jìn)行LC-MSD檢測(cè)，對(duì)收集的兩種物質(zhì)進(jìn)行簡(jiǎn)單的確證。
精密稱取羥基積雪草酸對(duì)照品10.0 mg，用甲醇配制成10.0g/L的溶液，然后用甲醇進(jìn)行倍比稀釋，配成質(zhì)量濃度依次為5.0，2.0，1.0，0.5和0.1g/L的羥基積雪草酸對(duì)照品甲醇溶液。以峰面積(y)對(duì)質(zhì)量濃度(x, g/L)進(jìn)行線性回歸,羥基積雪草酸的回歸方程為y = 116.54x一10. 058，r2=0.9989。結(jié)果表明,樣品量在0.1-5.0 g/L范圍內(nèi)濃度與峰面積呈線性關(guān)系。
精密配制羥基積雪草酸對(duì)照品0.5,1.0,2.0g/L3種濃度的甲醇溶液，每種濃度重復(fù)進(jìn)樣3次，連續(xù)測(cè)定5 d,其峰面積的日間精密度和日內(nèi)精密度(以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差( RSD)值計(jì))均小于2. 0%。
精密量取供試品溶液,按照前面的色譜條件,重復(fù)進(jìn)樣3次,按回歸方程計(jì)算供試品的含量,結(jié)果表明:50%積雪草總苷元中羥基積雪草酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18. 1%。
[1]潘見(jiàn)，開(kāi)桂青，袁傳勛，周蓓蓓，金日生，袁 媛，β一環(huán)糊精流動(dòng)相添加劑法分離測(cè)定積雪草 總苷元中的羥基積雪草酸，色 譜 Chinese Journal of Chromatography，2007.05，第317頁(yè)