手機(jī)掃碼訪問(wèn)本站
微信咨詢
偶氮胭脂紅 G 是一種酸性三苯甲烷類染料。
一、偶氮胭脂紅G分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)
在酸性介質(zhì)中，偶氮胭脂紅 G與蛋白質(zhì)在室溫下能迅速結(jié)合并導(dǎo)致體系的吸收光譜發(fā)生明顯改變。王琳琳等基于此結(jié)合反應(yīng)建立了一個(gè)測(cè)定蛋白質(zhì)的光度分析新法。
1、實(shí)驗(yàn)方法： 在 10 m L 比色管中， 依次加入適量的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液( 在條件實(shí)驗(yàn)中均加入 BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白)或樣品溶液，2 . 0 ×10-4 mol/ L的偶氮胭脂紅 G 溶液 1.0 mL 和 1.0 mol/L 的 H2SO4溶液2.0 mL，用水稀釋至刻度并搖勻，在室溫下以相應(yīng)的試劑空白為參比， 用 1 cm 比色皿，在波長(zhǎng)570 nm 處即時(shí)測(cè)定吸光度.
2 結(jié)果與討論
2.1吸收光譜 在酸性介質(zhì)中，偶氮胭脂紅 G 溶液為粉紅色，加入蛋白質(zhì)后 ，溶液由粉紅色變?yōu)樽霞t色，其吸收曲線如圖 1 所示。可見(jiàn)，在偶氮胭脂紅G 的試劑空白中加入牛血清蛋白質(zhì)后，導(dǎo)致試劑空白的吸收峰位由 520 nm 紅移至 570 nm，表明偶氮胭脂紅G 與 BSA 之間生成了復(fù)合物 . 實(shí)驗(yàn)選擇570 nm 作為測(cè)定波長(zhǎng).
2.2反應(yīng)酸度的選擇 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 蛋白質(zhì)與偶氮胭脂紅 G 之間的結(jié)合反應(yīng)只有在強(qiáng)酸性介質(zhì)中才能發(fā)生，結(jié)合體系的最大吸光度在 pH <1. 5 時(shí)依然沒(méi)有出現(xiàn)，于是實(shí)驗(yàn)采用 1.0 mol/ L的 H2SO4 直接控制體系的 pH，并試驗(yàn)了1.0 mol/L H2SO4 的加入量對(duì)結(jié)合體系吸光度的影響. 結(jié)果表明，1.0mol/L H2SO4 的加入量過(guò)高或過(guò)低都將導(dǎo)致結(jié)合體系吸光度的下降，而當(dāng) H2SO4 的加入量為 2.0mL 時(shí)，結(jié)合體系的吸光度達(dá)到最大值。因此，實(shí)驗(yàn)中加入 2.0 mL 1.0 mol/L 的 H2SO4 控制體系的酸度.
2.3偶氮胭脂紅 G 用量的選擇 在 0.5～3.5 mL范圍內(nèi)，優(yōu)化了2.0×10-4 mol/L 偶氮胭脂紅G 的用量。結(jié)果表明，隨偶氮胭脂紅 G 用量的增加，體系吸光度逐漸增大，但當(dāng)偶氮胭脂紅 G 用量的達(dá)到1.25 mL 以上時(shí)，體系放置 20 min 以上即有沉淀出現(xiàn)，為使體系的靈敏度最大，同時(shí)又具有一定的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)選擇偶氮胭脂紅 G 溶液的用量為1.0 m L .
2.4反應(yīng)溫度、時(shí)間、穩(wěn)定性及加入順序 在選定的酸度和染料用量條件下， BSA 與偶氮胭脂紅 G之間的結(jié)合反應(yīng)可在室溫下迅速發(fā)生，加入試劑混合均勻后，體系的吸光度就達(dá)到了最大值并與試劑的加入順序和放置時(shí)間(至少在 3 h 內(nèi)) 基本無(wú)關(guān)，說(shuō)明該體系具有快速、穩(wěn)定、簡(jiǎn)單的特點(diǎn).
2.5工作曲線與靈敏度 在上述選定的測(cè)定條件下，分別研究了體系在 570 nm 的吸光度與各蛋白質(zhì)濃度之間的關(guān)系，得到了牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HSA) 和免疫球蛋白(IgG) 的工作曲線及其線性回歸方程 ，并由線性回歸方程的斜率計(jì)算了摩爾吸光系數(shù)及 Sandell 靈敏度， 結(jié)果列于表 1中。由表 1 的數(shù)據(jù)可見(jiàn)，本法對(duì)于這 3 種蛋白質(zhì)的測(cè)定具有較寬的線性范圍和較好的靈敏度，且對(duì)人血清蛋白和免疫球蛋白具有非常相近的響應(yīng)，因此可用于血清樣品中總蛋白的測(cè)定 .
2.6 共存物的影響 對(duì)多種氨基酸、金屬離子及蛋白酶等對(duì) 5.0 μg/m L BSA 測(cè)定的影響進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。可見(jiàn)，當(dāng)允許相對(duì)誤差在±5%以內(nèi)時(shí)，大部分共存物的允許存在量較高，說(shuō)明方法具有較好的選擇性。
2.7 樣品分析 將方法直接用于稀釋1000 倍后的人血清樣品( 云南大學(xué)校醫(yī)院提供) 中總蛋白含量的測(cè)定，且在 1.0 mL 血清樣品中分別加入人血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收測(cè)定，其結(jié)果見(jiàn)表 3。可見(jiàn)，用本方法測(cè)得的結(jié)果與 CBBG -250 法測(cè)得結(jié)果基本一致.
[1]王琳琳，王俊芳，張媛，丁中濤，曹秋娥.偶氮胭脂紅G分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)的研究[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2008(01):83-86.