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作為螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase )的作用底物，常常用于以下實驗，
1）體內活體成像In vivo imaging ;熒光素酶標記的腫瘤細胞、干細胞或傳染疾病通常注射入研究動物模型比如大小鼠內進行研究，從而對動物模型進行實時和非侵略性的監測疾病進程和/或藥效。
2）體外研究In vitro study，包括熒光素酶和ATP水平分析﹔報告基因分析﹔高通量測序和各種污染檢測。
作用機制:在ATP和熒光素酶的作用下，D-熒光素（底物）被氧化發光。當熒光素過量時，產生的光量子數與熒光素酶的濃度呈正相關性(見下圖)。
機理闡釋（體內）:熒光素酶( Luc ) 催化底物D-熒光素，利用ATP和Mg2+作為輔因子，氧氣存在下發射一典型的黃綠光，之后在體內37°C下遷移到紅光。
機理闡釋（體外)∶很多因素都可能影響反應靈敏性，包括溫度、pH或底物濃度。建議使用pH 7.8的緩沖液，并且使用前將所有試劑預熱到室溫。建議反應緩沖液內添加過量的ATP和Mg2+以達到最佳反應狀態。
D-熒光素（D-Luciferin）是熒光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍應用于整個生物技術領域，尤其是體內活體成像技術。
將攜帶熒光素酶編碼基因（Luc）的質粒轉染入細胞后，導入研究動物如大、小鼠體內，之后注入熒光素，通過生物發光成像技術（BLI）來檢測光強度變化，從而實時監測疾病發展狀態或藥物的治療功效等。也可以利用ATP對此反應體系的影響，根據生物發光強度的變化來指示能量或生命體征。