2768-90-3/胰島素原的復性與純化

概述^[1][2]

胰島素原具有與胰島素相同的生物學作用，但其生理活性比胰島素弱，只有胰島素的3%～5%。然而，胰島素原的半壽期較長，約17.2分鐘，注入人體后的生物活性比胰島素持久。

胰島素原是胰島素的前身物，其分子結構為一條86個氨基酸殘基組成的直鏈多肽。在生理情況下，胰島素原分泌很少，占胰島素樣物質總量的5%～10%，但由于胰島素原的代謝清除率低于胰島素，前者為18～20min，而后者則為10～12min，故周圍血中胰島素原在胰島素樣活性物質中所占的比例略高于其實際比例，為10%～15%。

制備^[3]

重組人胰島素原的制備

將Streamline Q XL灌注擴張床層析柱(Streamline 100層析柱，GE)，用流動相Ⅰ(10mM Tris?HCl，pH9.0)平衡，從擴張床底部向上進液，流速調整為200cm/h，使擴 張床樹脂擴張到固定床體積的1倍，平衡約3個柱體積；

開始上樣含重組人胰島素原的大腸桿菌表達包涵體復性液50L，從擴張床底部向上進液，調整上樣流速為1000cm/h。使擴張床樹脂擴張到固定床體積的5倍；

上樣完畢，用流動相Ⅱ(10mM Tris?HCl，pH9.0，0.5M NaCl)洗滌，從擴張床底部 向上進液，流速調整為1000cm/h，使擴張床樹脂擴張到固定床體積的5倍，洗滌約10個 柱體積；

洗滌完畢，停泵，使樹脂自然沉降，然后將柱頂下降至樹脂表面并壓緊樹脂，從擴張 床頂部向下進液，流速調整為50cm/h，用流動相Ⅱ(10mM Tris?HCl，pH9.0，0.5M NaCl)： 流動相Ⅲ(10mM Tris?HCl，pH9.0，1.0M NaCl)開始梯度洗脫，梯度洗脫程序為40％～100％流動相Ⅲ梯度洗脫5個柱體積，收集洗脫峰。

經檢測并計算，重組人胰島素原的收率為89.2％，純度為91.3％。

復性與純化^[4]

（1）重組人胰島素原變性抽提液的準備

用E.coli作為宿主細胞表達重組人胰島素原(rhPI)蛋白，再將發酵菌液經離心、細胞破碎和分別用緩沖液Ｉ（20 mmol/L PBS，1 mmol/L EDTA，pH 7.4）和II（2.0 mol/L脲，1 mmol/L EDTA，1.0 mol/L NaCl，20 mmol/L PBS，pH 7.4）洗滌、并離心的粗純化后，得到的包涵體溶于8.0mol/L脲，20 mmol/LDTT，1.0 mmol/LEDTA，pH 8.0（或6～7 mol/L鹽酸胍，10～20mmol/LDTT，0.5～1mmol/LEDTA，pH7.0～8.0）的變性劑中，變性抽提液濃度為9.92 mg/mL，rhPI純度為65.7 %以上，電泳見圖1中條帶3。

（2）高效體積排阻色譜復性與純化重組人胰島素原

用流動相A（20 mmol/ LPBS，4.0mol/L 脲，pH6.5）平衡 HPSEC柱(TSK gel G2000SWXL，300 ×7.8 mm I.D.)，變性抽提液直接進樣200 μL，在流速0.3 mL/min下進行30 min的線性梯度洗脫, 直至流動相B（20 mmol/L PBS，pH 6.5）為100%, 延長10 min。rhPI質量回收率為42.5%，純度達到95%以上，色譜圖見圖2（A）的曲線3，質量回收率見圖2（B）中。

（3）用脫鹽色譜柱二次純化重組人胰島素原

用0?10 mmol/LPBS，pH6.0?7.0的流動相平衡的脫鹽色譜柱（HiTrap Desalting column），對復性與純化得到的含人胰島素原的色譜餾分I直接進樣，持續洗脫30 min，流速1.0ml/min。rhPI的純度達到了99%以上。見圖1中條帶5。

主要參考資料

[1] 協和醫學詞典

[2] 內科學·第二卷

[3] [中國發明,中國發明授權] CN201110406282.1 一種制備重組人胰島素原的方法

[4] [中國發明] CN201310065815.3 重組人胰島素原的復性與純化方法