34096-83-8關于單葡萄糖醛酸甘草次酸的介紹

【概述】^[1]

甘草酸( Glycyrrhizin，GL) 不僅是甘草中的主要藥效成分，也是目前傳統中草藥甘草的重點研究方向。有研究表明，甘草酸( Glycyrrhizin，GL) 具有一定的抗炎、抗病毒、抗過敏、抗腫瘤、解毒等方面的作用。單葡萄糖醛酸甘草次酸( GAMG) 作為甘草酸的衍生物，只含有一分子葡萄糖醛酸，其極性介于甘草酸和甘草次酸之間，能順利進入細胞，在機體內的溶解度和跨膜轉運能力比甘草酸和甘草次酸強。因而有更好的生物利用度。近20年內，部分外國學者對GAMG的抗炎、抗過敏、抗癌等生理活性進行一系列的實驗研究，并對其抗癌功效的作用機制進行了初步的探索，證實了18αGAMG 和18β-GAMG都有較強的抗癌作用。因此，開發GAMG作為一種高效新藥具有廣闊的應用前景。同時，GAMG作為一種較為安全的新型高倍甜味劑，在食品添加劑方面的應用前景廣闊。

通過化學水解法制備 GAMG 時， 其對 β-1，2 糖苷鍵和β-1，3糖苷鍵的選擇性很低， 因此， 采用高能耗和高污染的化學法制備 GAMG 會生成大量的副產物甘草次酸。微生物法以其污染小、 成本低、 產率高、 副產物少等優勢而得到更多研究者的青睞。我國對葡萄糖醛酸基甘草次酸的研究始于 20世紀中期，陸丁強等從鴨肝中篩選了葡萄糖醛酸苷酶能有效的將甘草酸水解生成產 物 GAMG， 李春等篩到一株紫青霉屬的微生物能定向的從甘草酸開始，去掉一分子葡萄糖醛酸生成 GAMG， 并對其發酵條件進行優化，摩爾轉化率達到80% 以上， 酶活為181.53 U /mL。但這些菌株的獲得量較少， 工業化生產 GAMG 存在一定的困難。

【制備方法】^[1]

由于 GAMG 的制備工藝比較困難， 從而限制了其 應 用。自 主 篩 選 出 能將GL特異性水解生產GAMG 的新的微生物菌株具有重要的意義。通過常壓室溫等離子體( ARTP) 誘變后， 篩選得到一株可水解GL生產GAMG 的藍狀真菌屬的有效菌株，且產率較高， 基本上無副產物生成。這不僅為工業化生產 GAMG 提供了一個新方向， 也簡化工藝并降低生產成本， 為后續的放大實驗及商業化生產提供新思路， 為后續將 GAMG 應用于食品、 醫藥、 化妝品等工業領域奠定堅實的基礎

1 菌株的篩選方法

1.1 富集培養 取 10.0 g 土樣溶于 10 mL 無菌水中充分混勻后， 接種 到 100 mL 富 集 培 養 基 中，30 ℃、 160 r /min 的搖床中培養 36 h。

1.2平板初篩 將富集液進行無菌水梯度稀釋后，取1×10-5、 1 × 10-6、 1 × 10-7 三個稀釋梯度 100 μL稀釋液均勻涂布于選擇培養基平板上，28～30 ℃ 培養3 d，挑出在此平板上長出的單菌，并進行分離純化。

1.3 搖瓶復篩 平板初篩的單菌株活化后， 以10% 的接種量接入發酵培養基中， 28 ℃、 160 r /min進行搖瓶培養，8000 r /min 離心 15 min 后取發酵上清液進行酶活測定， 檢測上述平板長出的菌株是否為 GAMG 產生菌，依據酶活高低篩選出產 GAMG 的菌株。

2 β-D-葡萄糖醛酸苷酶(β-GUS) 活力的測定方法

移取 200 μL 粗酶液加入到 800 μL 含有甘草酸濃度2 mg /mL、 pH5.0 的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液中，40 ℃ 條件下反應 1 h 后，沸水浴中使酶失活， 取反應液樣品過膜后在 HPLC 上檢測 GAMG 的含量。β-D-葡萄糖醛酸苷酶活力定義為在上述條件下，每小時生成1 μg的 GAMG 所需要的酶量為一個活力單位( U /mL) 。

3 常溫室壓等離子體誘變( AＲTP) 選育高產菌株

取活化好的有效菌株斜面， 用無菌生理鹽水洗下孢子， 采用無菌雙層擦鏡紙過濾， 即得單孢子懸液，涂布于金屬載片的表面上， 采用氦氣為工作氣體，設置處理功率為 120 W， 處理距離為 2 mm， 氣流量為 10 SLM， 對菌株進行誘變， 處理時間為 30、 60、90、 120、 150、 180、 210、 240 s。選擇合適的菌落平板進行計數來計算致死率，并繪制出致死曲線。同時挑取平板上的菌落進行發酵測定酶活。致死率計算公式:致死率( % ) = ( U－T) /U × 100， 其中 U 為不經誘變處理生長的菌落數，T 為經誘變處理后生長的菌落數。

4 突 變 株 的 穩 定 性 實 驗

將 所 篩 選 的 高 產β－GUS的突變菌株接入 PDA 培養基中， 連續傳代 10次，測定每次傳代后菌株發酵后的 β－ GUS 活性， 觀察其遺傳穩定性。

5 甘草酸和單葡萄糖醛酸甘草次酸的檢測方法

5.1 高效液相色譜( HPLC)

取發酵液上清用甲醇稀釋 10 倍后， 采用高效液相色譜( HPLC) 進行測定。HPLC 檢測條件: 色譜柱: Agilent 的 C18 反相色譜柱( 4.6 mm × 250 mm) ，乙腈和 0.1% 的甲酸水為流動相， 流速為1.0 mL /min， 柱溫為25 ℃ ， 進 樣 量 為10 μL，紫外檢測器，檢測波長 254 nm。標準曲線的制作: 稱取 10 mg 在105 ℃ 中干燥至恒重的 GAMG 標準品至燒杯中， 加入少量甲醇至10 mL容量瓶中定容，得到 1.0 mg /mL 的標準品溶液。將其分別稀釋為 20、 40、 60、 80、 100μg /mL濃度的標準品溶液，經 0.22 μm 濾膜過濾，取樣 10 μL 進行 HPLC檢測， 以 峰 面 積 ( mAU) 為 縱 坐 標， GAMG 的 濃 度( μg /mL) 為橫坐標， 繪制標準曲線， 其線性回歸方程為: y =7.4898x－77.1828，R2=0.9957，表明相關性良好。

5.2 液質聯用( LC－MS)

將發酵液樣品用甲醇進行適當稀釋過膜后， 采用電噴霧電離源， 負離子模式。通過 WATERS MALDI SYNAPT Q－TOF MS 對樣品進行測定。

5.3 紅外吸收光譜的測定

在半制備高效液相色譜上，進樣 100 μL 上清液， 收集相應的產物樣品，減壓蒸餾， 冷凍干燥，將得到的樣品在 NICOLET IS5型紅外光譜儀上用 KBr 壓片法進行測定。

5.4 核磁共振( NMR) 將半制備高效液相色譜

上收集 所 得 的 產 物 樣 品 和 GAMG 標 品 分 別 溶 于500 μL的氘代甲醇中， 采用 AVANCE III 400 型核磁共振儀在 25 ℃下進行測定。

【鑒定】^[1]

將 ARTP 誘變后酶活提高明顯的目的菌株 G39，通過 LC－MS、 FT－IR、 NMR的測定技術對該菌株發酵液的主要代謝產物進行物質鑒定以檢測所篩選的菌株對甘草酸的轉化結果。

1 質譜表征

取發酵上清樣品進行液質聯用的測定，采用電噴霧電離源， 負離子模式。電噴霧是一種軟電離源，通常很少或沒有碎片， 譜圖中只有準分子離子，因而只能提供未知化合物的分子量信息， 不能提供結構信息。由圖 3 可知，保留時間為 1.67 min的物質 A 的分子量為 822， 其為甘草酸， 保留時間為2.49 min 的物質 B 的分子量為 646， 為發酵的主產物GAMG。亦沒有副產物甘草次酸的生成。

2 紅外表征

樣品經預處理后， 其 FT-IR圖譜如圖 4 所示，分析可知，750 cm^-1 和 1375 cm^-1附近為有 C－H 吸收峰，1630～1680 cm^-1 附近有 C = O 吸收峰，2420 cm ^-1和 3450 cm ^-1附近有 O－H 吸收峰， 這與GAMG 中存在的吸收峰類型相符。

3 核磁共振

樣品的核磁信息如圖 5 所示，δH( 400 MHz, MeOD) 5.47 ( 1H,s),4.28 ( 1H,d,J 7.7),1.32( 3H,s),1.07( 3H,s),1.04( 6H,s),0.97( 3H,s),0.78( 3H,s),0.74 ( 3H,s) 。

GAMG 標品的核磁信息為δH( 400 MHz,MeOD) 5.48 ( 1H,s) ,4.28 ( 1H, d， J7.8),1.32 ( 3H,s) ,1.07 ( 3H,s),1.05 ( 3H,s),1.04( 3H,s),0.97( 3H,s),0.78( 3H,s), 0.74( 3H,s) 。這些分子結構及反應特征的圖譜表明， 發酵生產所制備的主產物為 GAMG。

【參考資料】

[1]郭立純,趙偉.產單葡萄糖醛酸甘草次酸菌株的篩選及發酵條件的優化[J].食品工業科技,2017,38(16):88-94.