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56-87-1/L-賴氨酸的制備方法

背景及概述[1]

L?賴氨酸是人體第一必須氨基酸,是合成核蛋白、血紅蛋白及合成脂肪酸代謝的重要載體?肉毒堿的重要成份,還是促進大腦神經細胞再生的重要氨基酸,賴氨酸可增加胃蛋白酶及胃酸分泌,因此能促進老人及兒童的食欲。賴氨酸對營養不良、乙型肝炎、支氣管炎等有一定的輔助療效。賴氨酸與鐵化合物一起,治療貧血效果顯著。

L-賴氨酸的制備方法

制備[1-3]

報道一、

(1)向L?賴氨酸鹽酸鹽中加入純化水(去離子水),L?賴氨酸鹽酸鹽與純化水的重量比為1∶1,混合均勻并完全溶解,放置待用;

(2)上柱吸附

將步驟(1)所得的溶解液按13L/分鐘的流速,加入裝有陽離子交換樹脂的離子交換柱內,至樹脂陽離子交換樹脂全部吸附賴氨酸、且柱子的排出液內不含有賴氨酸,然后用純化水通過交換柱內的樹脂進行洗滌,洗至柱子的流出液中無Cl?(此時流出液的pH為7);

(3)洗脫

然后用2mol/L的NH4OH(氨水)把L?賴氨酸洗脫下來,NH4OH以13L/分鐘的流速流經離子交換柱,當離子交換柱的流出液pH值上升至8.0時,流出液開始有茚三酮反應即L?賴氨酸開始流出,收集流出液;當離子交換柱的流出液pH值上升至9.0~12時茚三酮反應顏色深,此時L?賴氨酸含量高,洗脫至流出液無茚三酮反應即可停止收集;

(4)減壓濃縮

將收集液在0.2Mpa、60~62℃減壓濃縮趕氨,濃縮至原收集液體積的1/3時、加入此時濃縮液重量3.5%的活性炭進行脫色、過濾,冷卻結晶,即得L?賴氨酸。

采用電位滴定儀檢測并計算的產物純度為98.5%。

報道二、

游離L-賴氨酸固體的制備:稱取1.00kgL-賴氨酸鹽酸鹽加入到5.0L純化水中攪拌溶解澄清,然后將溶液加入到7.20kg活化后的強酸性陽離子交換樹脂柱上,緩慢沖洗樹脂柱,2-3h沖洗完,再繼續用純化水沖洗至中性和無氯離子(0.1mol/L硝酸銀監測和廣泛pH試紙)為止。用11.1kg5%v/v的氨水加入到樹脂柱上,緩慢沖洗樹脂柱2-3h左右,沖洗過程檢測pH值大于10時,開始收集堿性洗脫液,直到pH值減小到10左右停止收集。將收集到的溶液在60℃(-0.10~-0.08Mpa)減壓濃縮,濃縮出水和氨氣,直到無液滴滴出,繼續濃縮變成白色固體,向體系中加入8L的無水乙醇,繼續打漿析晶,打漿3h,析出所有固體,離心過濾出固體,直到無液滴滴出,將濾餅平鋪到搪瓷托盤,真空干燥(60±5℃,-0.08~-0.1Mpa)8h,將產品冷卻室溫,裝入密封袋密封陰涼處保存,得到游離L-賴氨酸固體776g,收率96.95%,純度:99.62%,HNMR(D2O):3.223-3.188(CHN)、2.848-2.794(2H/CH2N)、1.542-1.523、1.276(-CH2CH2CH2-)。LCMS(M+1):147.1127。

報道三、

L-賴氨酸的發酵方法包括賴氨酸一級種子培養、賴氨酸二級種子培養和賴氨酸發酵培養三個步驟。每個步驟的具體操作如下:

1、賴氨酸一級種子培養

配制賴氨酸一級種子培養基。本實施例中賴氨酸一級種子培養基包括蔗糖20g/L,硫酸鎂0.5g/L,磷酸二氫鉀1.5g/L,硫酸銨9g/L,酵母浸粉5g/L,蘇氨酸0.5g/L,蛋氨酸0.5g/L,味精7g/L,丙酮酸鈉0.5g/L,醋酸鈣1g/L。

將配制好的賴氨酸一級種子培養基,用20%(體積比)氫氧化鉀溶液調節pH值為6.0,通水蒸氣將培養基升溫至121℃,滅菌20min,開循環水降溫至36℃并維持恒定。開攪拌300rpm,按照通風比1:0.4通入無菌空氣,調節罐壓為0.05Mpa,并用氨水調節pH至6.7并維持恒定,校溶氧100%。

將產賴氨酸大腸桿菌搖瓶種子按賴氨酸一級種子培養基體積的1‰接到賴氨酸一級種子培養基中進行培養,培養過程中通過調節轉速、風量、罐壓控制溶氧30-50%,培養10h后,每隔2h取樣鏡檢并測總糖,當鏡檢菌體形態正常且總糖下降至10g/L時停止培養,得到賴氨酸成熟一級種子液。

2、賴氨酸二級種子培養

配制賴氨酸二級種子培養基。本實施例中賴氨酸二級種子培養基包括葡萄糖70g/L,硫酸鎂1g/L,磷酸二氫鉀1g/L,硫酸銨10g/L,玉米漿水解液1g/L,毛發水解液1g/L,甜菜糖蜜10ml/L,蘇氨酸0.4g/L,蛋氨酸0.4g/L,醋酸鈣2g/L。

將配制好的賴氨酸二級種子培養基,用氨水調節其pH值為6.2,通水蒸氣將培養基升溫至121℃,滅菌20min,開循環水降溫至37℃并維持恒定。開攪拌300rpm,按照通風比1:0.4通入無菌空氣,調節罐壓為0.05Mpa,用氨水調節pH值為6.6并維持恒定,校溶氧100%。將步驟(1)得到的成熟賴氨酸一級種子液按賴氨酸二級種子培養基體積的2%接到賴氨酸二級種子培養基中進行培養,培養過程中通過調節轉速、風量、罐壓控制溶氧30-50%,培養10h后,每隔2h取樣鏡檢并測還原糖,當鏡檢菌體形態正常且還原糖下降至8g/L時停止培養,得到賴氨酸成熟二級種子液。

3、賴氨酸發酵培養

配制賴氨酸發酵培養基。本實施例中賴氨酸發酵培養基包括葡萄糖20g/L,硫酸鎂0.5g/L,磷酸0.3/L,硫酸銨9g/L,玉米漿水解液0.5g/L,毛發水解液0.5g/L,甜菜糖蜜10ml/L,甜菜堿0.5g/L,醋酸鈣1g/L。

將配制好的賴氨酸發酵培養基,用20%氫氧化鉀調節其pH指為5.6,通水蒸氣將培養基升溫至121℃,滅菌20min,開循環水降溫至36℃并維持恒定。開攪拌400rpm,按照通風比1:0.3通入無菌空氣,調節罐壓為0.07Mpa,用氨水調節pH值為6.7并維持恒定,校溶氧100%。將步驟(2)得到的成熟賴氨酸二級種子液按賴氨酸發酵培養基體積的10%接到賴氨酸發酵培養基中進行培養,培養過程中通過調節轉速、風量、罐壓控制溶氧25-40%。

培養過程中每2h取樣測發酵液的還原糖濃度和氨氮濃度,當發酵液中的還原糖濃度下降至4g/L時,開始流加60%(m/v)葡萄糖溶液并維持發酵液的還原糖濃度為4g/L左右,當發酵液中的氨氮濃度下降至1g/L時,開始流加40%(m/v)硫酸銨溶液并維持發酵液中的氨氮濃度為1g/L左右。

參考文獻

[1][中國發明]CN201110456105.4L-賴氨酸的制備方法

[2][中國發明]CN202010925450.7一種游離L-賴氨酸固體的制備方法

[3][中國發明]CN201611239506.3一種L-賴氨酸的發酵方法

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