63231-63-0 / 核糖核酸的制備方法

背景及概述^[1]

核糖核酸是動物體內(nèi)一種生物大分子，是一種重要的免疫觸發(fā)劑或免疫調(diào)節(jié)劑。1967年通過肉瘤免疫綿羊制取的淋巴細胞核糖核酸對大鼠進行試驗，發(fā)現(xiàn)核糖核酸能抑制荷瘤鼠腫瘤的生長，甚至消除，首次證實了免疫核糖核酸能傳遞免疫信息。1982年林單坤等人把從免疫羊肝中提取得到的核糖核酸做成制劑注入體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)對腫瘤與癌癥有明顯的療效并能提高機體的免疫功能，而且未出現(xiàn)不良的副作用。從脾臟中提取得到的免疫核糖核直接制成針注入體內(nèi)，可激活人體的T細胞及B細胞的活性；同時有提高人體免疫功能的作用，對一些與人體免疫功能下降有關(guān)的疾病，如慢性支氣管炎、哮喘病、慢性乙型肝等，以及胃癌、乳腺癌、大腸癌等惡性腫瘤有顯著的療效。

制備^[1]

制備核糖核酸

一、配制溶液

(1)提取緩沖液(0.02M Tris-乙酸緩沖液)

900ml純化水，加2.42克Tris，用乙酸調(diào)pH5.0，定容至1000ml。

(2)飽和酚液體

將苯酚在50℃融化，加入等體積提取緩沖液，攪拌均勻制成飽和酚溶液，避光保存。

(3)助沉淀緩沖液

3M乙酸鈉溶液，pH5.0

(4)溶解緩沖液

1M NaCl溶于0.05M Tris-HCl緩沖液中，pH9.5。

二、提取過程

1、原材料選擇和預(yù)處理

取小牛(1歲半以下)胰腺50公斤在25℃左右去筋膜、脂肪及結(jié)締組織等非胰腺組織，用純化水清洗干凈，切成3～5cm小塊。

2、組織及細胞的破碎

用干凈絞肉機將胰腺小塊絞碎，將絞碎的小牛胰腺移入膠體磨中，加入等量提取緩沖液，第一次以200μm破碎研磨，第二次以50μ研磨，真空下，研磨液應(yīng)較易通過200目不銹鋼網(wǎng)，得到100kg左右的勻漿液。

3、有效成份提取

勻漿液加入1倍體積飽和酚液體的上層水相，加入0.5倍體積飽和酚液體的下層酚相，加熱到60℃，恒溫120分鐘，迅速冷卻，在4～10℃離心(4000g，30分鐘)，收集上清液，棄去沉淀(回收苯酚)。

上清液加入0.6倍體積氯仿-異戊醇(體積比24∶1)，搖勻15分鐘，在4～10℃離心(4000g，30分鐘)，收集上層的上清液，棄去中間層沉淀，回收底層氯仿層。

上清液加入0.3倍體積氯仿-異戊醇(體積比24∶1)，搖勻15分鐘，在4～10℃離心4000g，30分鐘)，收集含核糖核酸的上層上清液，棄去中間層沉淀，回收底層氯仿層。

上清液加入1倍體積助沉淀緩沖液，再加入2倍體積乙醇(95％)，搖勻，4℃放置過夜，在4～10℃離心(4000g，30分鐘)，收集核糖核酸沉淀，上層的上清液為乙醇，回收乙醇。

為了能進一步提高核糖核酸的純度，減少雜質(zhì)含量，核糖核酸沉淀以溶解緩沖液溶解，加入乙醇至終濃度75％(質(zhì)量)，在4～10℃下離心(4000g，30分鐘)。

用75％乙醇反復(fù)洗滌沉淀2次，在4～10℃離心(4000g，30分鐘)，收集核糖核酸沉淀，置50℃水中放置到無醇味(約1小時)。

以上過程提取過程可在16～18時間內(nèi)完成，核糖核酸的提取率為3.8g/kg胰臟，較已有的核糖核酸提取工藝大大縮短了提取時間，產(chǎn)量提高1～2倍。在核糖核酸提取過程中，總會帶有少量DNA雜質(zhì)，由于DNA分子一般均比較大，注射時會間接引起過敏反應(yīng)。本發(fā)明由于核糖核酸提取效率的提高，核糖核酸產(chǎn)品中RNA含量在99.7％左右，純度0D260/0D280＞1.9，相比現(xiàn)有技術(shù)所提取得到的產(chǎn)品(RNA含量為95-96％)，產(chǎn)品純度有了很大的提高，脫氧核糖核酸“污染”含量降低，能提高產(chǎn)品安全性；并且，提取過程批成品率提高30％左右，批報廢率由30％降低到零，成本降低70％左右。

參考文獻

[1] [中國發(fā)明,中國發(fā)明授權(quán)] CN200710099981.X 核糖核酸及其制備方法與應(yīng)用