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柚皮素是一種典型的黃酮類化合物，具有多種保健功效，例如抗肥胖癥、抗糖尿病、抗高血脂、高血壓等。從植物中提取是柚皮素的重要來源，但是植物提取法受季節(jié)性影響和產(chǎn)地影響較大，而微生物法合成具有多重優(yōu)勢(shì)，例如生產(chǎn)強(qiáng)度高、反應(yīng)條件溫和、可以利用廉價(jià)碳源等，因此微生物法合成柚皮素具有巨大潛力。
圖1 在釀酒酵母中高效合成柚皮素策略
釀酒酵母具有生物量高、生長(zhǎng)迅速、遺傳背景清晰、改造技術(shù)成熟等優(yōu)點(diǎn)，可作為優(yōu)良的柚皮素生產(chǎn)宿主。在釀酒酵母中從頭合成柚皮素需要依次外源導(dǎo)入四個(gè)基因，分別是酪氨酸解氨酶(tyrosine ammonia lyase，TAL)，4-羥基肉桂酰輔酶A連接酶(4-hydroxycinnamoyl-CoAligase，4CL)，查爾酮合酶(chalconesynthase，CHS)和查爾酮異構(gòu)酶(chalconeisomerase，CHI)。釀酒酵母本身具有經(jīng)莽草酸途徑合成酪氨酸的能力，以酪氨酸為前體，經(jīng)過上述四個(gè)外源基因的催化合成柚皮素。但是在釀酒酵母中異源合成柚皮素，限速步驟依然未能探索清楚，這限制了在釀酒酵母中高效合成柚皮素及下游衍產(chǎn)物。
圖2 用于鑒定限速步驟的菌株基因型
本研究首先將四個(gè)外源基因整合在釀酒酵母基因組上，構(gòu)建了一株可以從頭合成柚皮素的菌株。以此菌株作為平臺(tái)，驗(yàn)證在釀酒酵母合成柚皮素的限制步驟。首先在平臺(tái)菌株上整合表達(dá)莽草酸途徑的抗反饋抑制基因ARO4K229L(3-deoxy-7-phosphoheptulonatesynthase，3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶)、ARO7G141S(chorismate mutase，分支酸變位酶)、來自于大腸桿菌的莽草酸激酶ecoaroL(shikimate kinase)，通過強(qiáng)化莽草酸途徑鑒定出莽草酸途徑代謝通量低是合成柚皮素的第一個(gè)限速步驟。然后再分別單獨(dú)過表達(dá)四個(gè)外源基因，驗(yàn)證四個(gè)外源基因?qū)﹁制に睾铣傻挠绊懀b定出CHS活性低是合成柚皮素的第二個(gè)限速步驟。在鑒定限速步驟后，通過添加不同的前體確定對(duì)第一個(gè)限速步驟的解除程度，驗(yàn)證了直接添加對(duì)香豆酸可以最大程度解除第一個(gè)限速步驟。然后從水飛薊中分離鑒定了一個(gè)高酶活的SmCHS，并過表達(dá)，以此解除第二個(gè)限速步驟。經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化，可以在5-L發(fā)酵罐水平積累648.63 mg/L的柚皮素。
圖3 不同菌株的柚皮素積累量
研究工作得到了國(guó)家重點(diǎn)研究發(fā)展計(jì)劃（2017YFC1600403），國(guó)家優(yōu)秀青年科學(xué)基金（21822806），國(guó)家自然科學(xué)基金（31670095、31770097）等項(xiàng)目的資助，以“Efficientbiosynthesis of (2S)-naringenin from p-coumaric acid in Saccharomycescerevisiae”發(fā)表在期刊Journal of Agricultural and Food Chemistry上（Gao et al., J. Agric. Food Chem. 2020, 68, 1015−1021）。博士生高松為論文第一作者，陳堅(jiān)教授和周景文教授為通訊作者。
圖4 最佳菌株在5-L發(fā)酵罐水平發(fā)酵優(yōu)化
