9000-90-2 / alpha-淀粉酶的制備方法

背景及概述^[1]

alpha-淀粉酶即α-淀粉酶，廣泛存在于生物界。alpha-淀粉酶能夠催化隨機水解淀粉的 α?1，4?糖苷鍵，產生麥芽糖、麥芽三糖和α糊精。alpha-淀粉酶廣泛應用于飴糖、啤酒、黃酒、葡萄糖、酒精、白酒、味精和醫藥等行業。

制備^[1]

（1）載體pxmj19-aph213的制備。

載體pxmj19-aph213的構建過程如下：

以引物aph213F和aph213R從載體xk99e載體上擴增出aph213基因，所用的引物如下：

aph213F：ccggatatcagcttcacgctgccgcaagcac

aph213R：ccgaagcttaattctgtttcctgtgtgaaattg

PCR條件如下：95℃ 4min；95℃ 30s、62℃ 30s、72℃ 1min，35個循環；72℃ 7min。

上述引物的設計使得aph213基因擴增過程中，在aph213基因上游形成EcoRV切點、下游形成HindIII 切點，aph213的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；回收PCR產物并以EcoRV和HindIII酶切，通過T4DNA連接酶，連接到同樣經過EcoRV和HindIII酶切的載體pxmj-19上，獲得載體pxmj19-aph213。

載體pxmj19-aph213的擴增過程如下：

a、在50ml離心管中加入3ml的LB培養基，加入1.5ul的34mg/ml的氯霉素抗生素；

b、挑取帶有載體pxmj19-aph213的大腸桿菌DH5α轉接至上述培養基中，在37℃，230rpm的條件下培養12h，以擴增pxmj19-aph213質粒；

c、根據質粒提取試劑盒的說明書提取pxmj19-aph213質粒。

（2）枯草芽孢桿菌的α-淀粉酶基因的擴增與改造。

以引物AmyF和AmyR從枯草芽孢桿菌的基因組上擴增出α-淀粉酶基因，所用的引物如下：

AmyR：ccgctcgagtcagtggtggtggtggtggtgatggggaagagaaccgcttaag；

AmyF：ccgaagcttgaaaggaggacctaatgtttgcaaaacgattcaaaacc；

PCR條件如下：95℃ 4min；95℃ 30s、62℃ 30s、72℃ 2min，35個循環；72℃7min。

上述引物的設計使得α-淀粉酶基因擴增過程中，在α-淀粉酶基因上游形成e3 SD序列、下游形成組氨酸標簽，上游酶切位點為HindIII，下游酶切位點為XhoI；

（3）構建重組載體。

回收PCR產物并用XhoI和HindIII酶切，通過T4DNA連接酶，連接到同樣經過XhoI和HindIII酶切的載體pxmj19-aph213上，獲得重組表達載體pxmj19-aph213-amy。

（4）構建重組菌。

將重組表達載體pxmj19-aph213-amy轉入大腸桿菌中進行預擴增，培養基為LB培養基，氯霉素濃度為50ug/ml；提取后，用電轉化的方法轉入谷氨酸棒桿菌中，在LBHIS恢復培養基中30℃培養，氯霉素濃度為30ug/ml。

（5）培養重組菌，分泌表達α-淀粉酶。

將長出的轉化子轉接到裝有50ml培養基的250ml的三角瓶中進行培養，培養基為BHI培養基，培養條件為30℃，230rpm，48h。

（6）α-淀粉酶的純化。

a、將重組菌的培養物進行離心，12000rpm、4℃、5min，獲得含有α-淀粉酶的上清。

b、將含有α-淀粉酶的上清進行親和層析，首先用緩沖液A平衡鎳柱，將含有α-淀粉酶的上清過濾并上樣至平衡后的鎳柱，繼續用緩沖液A平衡至基線水平后繼續平衡3個柱體積；用100mmol的B液洗脫，收集洗脫的洗脫液，每管收集0.5ml；

緩沖液A為：300mM NaCl，20mM Tris，pH8.0的緩沖液，緩沖液B為：300mM NaCl，250mM 咪唑，20mM Tris，pH8.0的緩沖液。

c、對含有α-淀粉酶的洗脫液通過脫鹽柱進行脫鹽，獲得純化的α-淀粉酶溶液，-20℃保存；

脫鹽用的緩沖液為50mM的PBS緩沖液，pH為7.0。

參考文獻

[1] [中國發明,中國發明授權] CN201610836135.0 α-淀粉酶的制備方法【公開】/α-淀粉酶的制備方法【授權】