9003-98-9 / 一種植物核酸酶及其編碼基因與應用

背景技術

核酸分解的第一步是水解核苷酸之間的磷酸二酯鍵，在高等動植物中都有作用于磷酸二酯鍵的核酸酶。不同來源的核酸酶，其專一性、作用方式都有所不同。有些核酸酶只能作用于RNA，稱為核糖核酸酶（RNase)，有些核酸酶只能作用于DNA，稱為脫氧核糖核酸酶（DNase)，有些核酸酶專一性較低，既能作用于RNA也能作用于DNA，因此統稱為核酸酶 (nuclease)。

植物中DNase參與衰老、發育過程中的程序性死亡（P⑶）、超敏反應等，很多與DNA 的修復相關。在植物PCD過程中有DNA的損傷和降解，已經陸續檢測到和克隆出了該過程有關的DNase。在西紅柿的葉衰老過程中檢測到了兩個nuclease。百日草中克隆到ZEW， 認為ZEm是直接參與管狀分子PCD的DNase。在小麥的糊粉層細胞凋亡中發現了定位在核內的GA誘導的nuclease。從擬南芥中克隆到DNaseBFNl，可能和葉的衰老過程有關。DNase 可以根據依賴離子的不同分類，也可以根據對底物的偏好分類。

擬南芥的CAN基因在2000年被克隆，已證明CAN有依賴鈣離子的DNase活性，但是缺乏深入的功能分析。CAN與葡萄球菌細胞外核酸酶類似，有一個SNc結構域，它的酶活性可被鋅離子抑制，在細菌中已經發現很多與葡萄球菌細胞外核酸酶同源的基因，例如， Shigella flexneri中pSa質粒上的nuc基因，大腸桿菌中RP4質粒上的parB基因。高等植物中第一個與葡萄球菌同源的DNase基因在紫堇屬（Corydalis sempervirens)中發現，植物中其他同源的基因陸續被克隆，現已經從煙草、楊樹、水稻等多種植物中找到該類基因。

雖然已克隆到很多DNase，但它們在植物P⑶過程中所起的作用，所處的地位尚不明確，與動物相比，植物PCD過程的研究仍然處于起步階段。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種核酸酶及其編碼基因。

本發明所提供的核酸酶，名稱為CsCaN，來源于黃瓜，是如下（a)或（b)的蛋白質：

(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

(b)將序列3的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有核酸酶活性的由序列3衍生的蛋白質。

序列表中的序列3由334個氨基酸殘基組成，自序列3的氨基末端第220-330位氨基酸殘基是保守的SNc結構域。

所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列3的SNc結構域外進行取代和/或缺失和/或添加。

為了使（a)中的CsCaN便于純化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。

表1標簽的序列

黃瓜核酸酶CsCaN的篩選及其cDNA的克隆

因為黃瓜雌花雄蕊在特定的時期開始出現花藥特異的DNA損傷，并且檢測到該過程中有DNase活性物質存在，推測可能DNase導致DNA的損傷的發生，從而引起雄蕊原基的滯育，產生單性花，那么這個導致DNA損傷的DNase基因就是一個關鍵的執行分子，很值得研究。在黃瓜雌花雄蕊的發育過程中，一定有很多基因參與這個發育調控的過程，所以通過克隆發育調控的基因，解析這一過程。

通過抑制消減雜交找到差異表達的基因，得到一系列基因，然后再篩選符合預期的基因，找到DNase的EST，EST序列如序列表中的序列1所示。

根據EST序列設計引物如下：

3，RACE 引物

Nucleases' racel 5，GCTGAGGCTTGGAAGACGGAGAA 3，

Nucleases' race2 5’ CAGACGCTGCCAGTTGATGCC 3’

Nucleases' race3 5，AAGACAATCACGGATGCTGGTTACA 3，

5，Race 引物

Nuclease 5， race3 3， AACCGACTCCGAACCTTCTGCCTC 5，

Nuclease 5， race2 3， CTGCGACGGTCAACTACGGTTTCG 5，

Nuclease 5’ racel 3’ TCGTGTAGTGTGGGCTCTCTCAGGAG 5’

反轉錄引物 Nuclease 5，raceRT 3，TTACTCCTCCAAGAA 5，

利用帶oligo dT的反轉錄引物反轉錄合成第一鏈cDNA，用通用引物和上面的三個PCR引物順序進行嵌套PCR，對最終得到的產物進行測序，得到全長的CsCaNcDNA序列。 PCR流程見CL0NTHCH公司SMART-RACE試劑盒。

用Trizol (invitrogen)提取中農五號（中國農科院蔬菜花卉研究所）黃瓜花的總RNA，用superscriptll(invitrogene)反轉錄酶反轉錄獲得到cDNA。根據全長的CsCaN cDNA序列，設計引物Pl和P2。以反轉錄得到的cDNA為模板，用引物Pl和P2進行PCR擴增。引物Pl和P2的序列如下：

Pl :5，-ct-gaaggatttc-ATGGGAAACGCACTCAGGT-3，， P2 ： 5，-ca-gtcgac-TTATTTCCCCTCACGCTTTC-3，。

對PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到分子量約為Ikb的條帶，與預期結果相符。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（TIANGEN)回收該片段。將該回收片段與PGEM-T Easy (Promega)連接，參照 Cohen 等的方法（Proc Natl Acad Sci，69 :2110)，將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，根據pGEM-T Easy載體上的氨卞青霉素抗性標記篩選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質粒。以該重組質粒載體上的T7和SP6啟動子序列為引物對其進行核苷酸序列測定，測序結果表明擴增到的CsCaN基因由1005個脫氧核糖核苷酸組成，其開放閱讀框（ORF)為序列表中序列2的自5'末端第1至1005位脫氧核糖核苷酸，編碼氨基酸序列是序列表中序列3的蛋白質。將含有序列表中序列2的自5'末端第1-1005 位脫氧核糖核苷酸的CsCaN基因的重組載體命名為pTE-CsCaN。

利用軟件分析CsCaN的等電點和分子量，結果表明pi = 9. 55 ；Mw = 37454. 75。自序列3的氨基末端第220位-330位為SNc結構域。然后根據⑶S序列，設計基因兩端的序列進行PCR得到基因組DNA序列（序列表中序列4)。該序列含有9個外顯子，8個內含子。