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產品及特點 ：
1. 一站式，用于不需要單獨準備每種成分，包括引物和對照。
2. 根據Colti 病毒的保守基因序列設計的引物，具有良好的特異性。
3. 基于染料法 qRT-PCR 檢測，靈敏度比常規 RT-PCR 高 10-100 倍，可以達到至少 1000 拷貝/反應。
4. 使用一管式 qRT-PCR 技術，RT 和 PCR 兩步在一個試管內完成，不需要中間轉移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。
5. 本產品足夠 50 次 30μL 體系的 RT-PCR。
規格及成分：
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編號 |
成分 |
規格 |
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試劑一 |
2×qRT-PCR 緩沖液 |
500 μL（棕色管） |
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試劑二 |
10×qRT-PCR 酶混合液 |
100 μL（紅蓋） |
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試劑三 |
ROX 染料 I，50× |
20 μL（棕色管） |
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試劑四 |
ROX 染料 II，50× |
20 μL（棕色管） |
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試劑五 |
熒光 PCR 專用模板稀釋液 |
1mL（黃蓋） |
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試劑六 |
Colti 病毒染料法 qRT-PCR 引物混合液 |
100 μL（白蓋） |
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試劑七 |
Colti 病毒染料法 qRT-PCR 陽性對照 （1×10E8 拷貝/μL） |
50 μL（黃蓋） |
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試劑八 |
沙核酸釋放劑（試用裝） |
20 次（1mL，綠蓋） |
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試劑九 |
使用手冊 |
1 份 |
低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。
陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨放置。本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供 DNA 片段作為陽性對照。
自備試劑：
樣品 RNA。
使用方法：
一、稀釋陽性對照：
以10E2-10E7這6個10倍稀釋度為例，由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原。
1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
2. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
3. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備：
5. 如果有 N 個樣品，必須設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第 4 號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當于 1 萬拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ铡?/span>
6. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒 RNA 提取試劑盒兼容。
三、設置RT-PCR 反應（20 μL 體系，在樣品制備室進行）：
7. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號陽性對照稀釋液做模板）。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把 6 個標曲反應縮減成 1 個，其余不變。
8. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加）：
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成分 |
N+2個制備所得樣品 |
qRT-PCR 陰性對照 |
qRT-PCR 陽性對照 （2-7 管） |
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2×qRT-PCR 緩沖液 |
10μL |
10 μL |
各 10 μL |
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Colti 病毒染料法qRT-PCR 引物混合物 |
2 μL |
2 μL |
各 2 μL |
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50×ROX (見注) |
0.4μL |
0.4μL |
各 0.4μL |
|
樣品制備所得 RNA 模板 （來于第 8 步） |
5.6μL |
-- |
-- |
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稀釋所得 6 個陽性對照 （來于第 6 步） |
-- |
-- |
各 5.6μL（2 號樣到 2 號 管，3 號樣到 3 號管…） |
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超純水 |
-- |
5.6μL |
-- |
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10×qRT-PCR 酶混合液 |
2μL |
2μL |
2μL |
注：需使用 ROX 染料 I 的機型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
需使用 ROX 染料 II 的機型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用ROX 的機型：Thermal Cycle Dice Real Time System，LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。
9. 上機后按下面參數進行 RT-PCR（參數可能會因儀器不同而需優化）。
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過程 |
溫度 |
時間 |
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RT（逆轉錄） |
50℃ |
15-30 min |
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預變性 |
95℃ |
5 min |
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Qrt-PCR反應 40 個循環 |
95℃ |
15 sec |
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58℃ |
1 min,（采集FAM通道的熒光信號） |
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按儀器預設程序進行溶解曲線分析 |
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四、數據處理：
10. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。
11. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。
