豬腸病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

品牌：紀(jì)寧生物

貨號：JN28656

規(guī)格： 50次

聯(lián)系方式：021-54721350

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產(chǎn)品詳情

豬腸病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒
產(chǎn)品及特點：
豬腸病毒(Porcine Enterovirus,PEV)是一種RNA病毒，引起的最嚴(yán)重的疾病是腦脊髓灰質(zhì)炎，它感染所有日齡的豬，已造成了巨大的經(jīng)濟損失。在發(fā)病初期表現(xiàn)為發(fā)熱，厭食，精神不振，然后動物迅速出現(xiàn)共濟失調(diào)。在嚴(yán)重病例中，可能出現(xiàn)眼球震顫、抽搐，角弓反張和昏迷。一些病豬可以在精心照料下得以恢復(fù)，但這些病例常出現(xiàn)肌肉萎縮或者后遺性癱瘓，因此豬腸病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用。本產(chǎn)品基于PCR原理開發(fā)。
1. 一站式，用于不需要單獨準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對照。
2. 根據(jù)豬腸病毒的保守基因序列設(shè)計的引物，具有良好的特異性。
3. 基于染料法 qRT-PCR 檢測，靈敏度比常規(guī) RT-PCR 高 10-100 倍，可以達到至少 1000 拷貝/反應(yīng)。
4. 使用一管式 qRT-PCR 技術(shù)，RT 和 PCR 兩步在一個試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 30μL 體系的 RT-PCR。
規(guī)格及成分：

編號	成分	規(guī)格
試劑一	2×qRT-PCR 緩沖液	500 μL(棕色管)
試劑二	10×qRT-PCR 酶混合液	100 μL(紅蓋)
試劑三	ROX 染料 I，50×	20 μL(棕色管)
試劑四	ROX 染料 II，50×	20 μL(棕色管)
試劑五	熒光 PCR 專用模板稀釋液	1mL(黃蓋)
試劑六	豬腸病毒染料法 qRT-PCR 引物混合液	100 μL(白蓋)
試劑七	豬腸病毒染料法 qRT-PCR 陽性對照 (1×10E8 拷貝/μL)	50 μL(黃蓋)
試劑八	沙核酸釋放劑(試用裝)	20 次(1mL，綠蓋)
試劑九	使用手冊	1 份

運輸及保存：
低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。
陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供 DNA 片段作為陽性對照。
自備試劑：
樣品 RNA。
使用方法：
一、稀釋陽性對照：
以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例，由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原。
1. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同)。
2. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
3. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備：
5. 如果有 N 個樣品，必須設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC(樣品制備陽性對照)，一個是 NC(樣品制備陰性對照)。可以用 10μL 上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第 4 號(濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝)再加上一定量的水作為制備的陽性對照(加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求)。可以用水作為制備的陰性對照。
6. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置 RT-PCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進行）：
7. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板)，1 個用于 PCR 陽性對照(用第 4 號陽性對照稀釋液做模板)。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把 6 個標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 1 個，其余不變。
8. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加)：

成分	N+2個制備所得樣品	qRT-PCR 陰性對照	qRT-PCR 陽性對照 (2-7 管)
2×qRT-PCR 緩沖液	10μL	10 μL	各 10 μL
豬腸病毒染料法qRT-PCR 引物混合物	2 μL	2 μL	各 2 μL
50×ROX (見注)	0.4μL	0.4μL	各 0.4μL
樣品制備所得 RNA 模板 (來于第 8 步)	5.6μL	--	--
稀釋所得 6 個陽性對照 (來于第 6 步)	--	--	各 5.6μL(2 號樣到 2 號管，3 號樣到 3 號管…)
超純水	--	5.6μL	--
10×qRT-PCR 酶混合液	2μL	2μL	2μL

注：需使用 ROX 染料 I 的機型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
需使用 ROX 染料 II 的機型：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用ROX 的機型：Thermal Cycle Dice Real Time System，LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。
9. 上機后按下面參數(shù)進行 RT-PCR(參數(shù)可能會因儀器不同而需優(yōu)化)。

過程	溫度	時間
RT（逆轉(zhuǎn)錄）	50℃	15-30 min
預(yù)變性	95℃	5 min
Qrt-PCR反應(yīng) 40 個循環(huán)	95℃	15 sec
Qrt-PCR反應(yīng) 40 個循環(huán)	58℃	1 min,（采集FAM通道的熒光信號）
按儀器預(yù)設(shè)程序進行溶解曲線分析

四、數(shù)據(jù)處理：
10. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。
11. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。

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豬腸病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

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