人絲裂原活化蛋白激酶激酶4(MKK4)ELISA試劑盒
本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床診斷
?本試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中人絲裂原活化蛋白激酶激酶4（MKK4）的含量。
?有效期：6個月
?保存條件：2-8℃
試劑盒組成：
備注：
1.（96T/48T）打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全。
2.標準品濃度依次為：160、80、40、20、10、5 pg/mL
3.經(jīng)過大量正常標本檢驗，標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi)，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當有部分樣本值超過最大標準品濃度時，可用樣本稀釋液將標本進行適當稀釋后再進行實驗。
檢測前準備工作：
1.請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。
2.從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正常現(xiàn)象；放置室溫，輕搖均勻，待結(jié)晶完全溶解后再配置洗滌液。可將20ml濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水稀釋配置成400ml工作濃度的洗滌液，未用完的放回4℃
3.20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。
實驗原理：
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被人絲裂原活化蛋白激酶激酶4（MKK4）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人絲裂原活化蛋白激酶激酶4（MKK4）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。
實驗所需自備試驗器材：
1.酶標儀（450nm）
2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.37℃恒溫箱
4.蒸餾水或去離子水
樣本處理及要求：
1.血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2.血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3.組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。
4.細胞培養(yǎng)物上清：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
5.其它生物標本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。
6.樣品外觀：樣品應清澈透明，懸浮物應離心去除。
7.樣品保存：樣品收集后若在1周內(nèi)進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內(nèi)檢測），或-80℃（6個月內(nèi)檢測），避免反復凍融，標本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
注意事項：
1.嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
2.洗板不正確可以導致不準確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
3.消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。
4.底物顯色液應呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍的底物液不能使用。
5.避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果。
6.在儲存和溫育時避免強光直接照射。
7.平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
8.任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。
9.不能使用過期產(chǎn)品。
10.如果可能傳播疾病，所有的樣品都應管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
操作步驟：
1．從室溫平衡60min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2．設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL。
3．樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。
4．除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5．棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7．每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。
實驗結(jié)果計算：
繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。
（此圖僅供參考）
1.檢測范圍：5 pg/mL – 160 pg/mL。
2.靈敏度：最低檢測濃度小于1.0 pg/mL。
3.特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應。
4.重復性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ，板間變異系數(shù)小于15% 。
技術(shù)小提示：
1.當混合或重溶蛋白溶液時，盡量避免起沫。
2.為了避免交叉感染，配置不同濃度標準品、上樣、加不同試劑都需要更換槍頭。另外不同試劑請分別使用不同的移液槽。
3.每次孵育時，請正確使用封板膠可保證結(jié)果的準確性。
4.混合后的顯色底物在上板前應為無色，請避光保存；假如微孔板后，將由物色變成不同深度的藍色。
5.終止液上板順序應同顯色底物上板順序一致；加入終止液后，孔內(nèi)顏色由藍變黃；若孔內(nèi)有綠色，則表明孔內(nèi)液體未混勻；請充分混合。
說明：
1.由于現(xiàn)有條件及科學技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風險。
2.最終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當時的實驗環(huán)境密切相關(guān)，請務必準備充足的標本備份。
3.不同批次的同一產(chǎn)品可能會有少許差別，如：檢測限、靈敏度以及顯色時間等，請依據(jù)試劑盒內(nèi)說明書進行實驗操作，網(wǎng)站電子版說明書僅作參考。
4.只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴格遵守本試劑盒的實驗說明才會得到最佳的檢測結(jié)果。
