在進行ELISA實驗過程中也會經常遇到一些問題，這些問題會阻礙我們實驗進程，了解ELISA實驗常見問題有助于提高實驗的效率，上海紀寧為大家整理了ELISA試劑盒常見的問題

  Elisa常見問題

  1.樣品如何保存？

  我們始終建議盡可能使用新鮮樣品（通常這些樣品會產生最佳結果）。或者，樣品可以儲存在–20°C、–80°C或液氮中（取決于樣品）。

  2.是否可以使用試劑盒說明書中未推薦的樣本類型？

  大多數情況下是的，只要預期濃度在試劑盒的范圍內（理想情況下應該是中間范圍）。需要注意的是，說明書中提到的樣品類型已經過驗證，并確認在指定條件下有效。其他樣品類型尚未經過測試，因此無法保證它們是否有效。

  3.試劑盒的保存溫度是多少？

  試劑盒的推薦儲存溫度通常為2-8°C。但是，試劑盒中的某些試劑可能需要在-20°C下儲存。務必按照說明書對所有試劑正確儲存條件，這將確保試劑盒發揮最佳性能。

  4.必須遵循ELISA說明書進行實驗嗎？

  試劑盒都經過精心優化，隨意更改其中的參數（例如孵育時間、溫度、試劑濃度等）都會影響抗原抗體反應、顯色反應等，最終影響實驗結果。

  5、其它試劑可以應用本試劑盒實驗嗎？

  ELISA試劑盒是一個經過精心匹配和優化的系統，各個組分之間相互協調才能保證實驗的準確性和可靠性。除非試劑盒說明書明確允許使用某些替代試劑，否則強烈建議使用試劑盒提供的全部組分，以確保實驗結果的準確性和可靠性。

  6.可使用的樣品量和濃度是多少？

  樣品體積通常在50-100μl之間，但這可能因檢測而異。建議將樣品稀釋至試劑盒的中間范圍，以獲得最佳結果。此外，請注意，接近范圍下限的低濃度可能無法準確檢測，因為已知ELISA檢測的范圍會隨著時間的推移而丟失，或者如果試劑盒沒有適當保存。請勿改變說明書中推薦的樣品體積，因為這些體積是為實現最佳性能而設計的。相反，建議使用更稀釋或更濃縮的樣品。

  7.如何處理產生的值超出分析動態范圍的樣本？

  產生的值高于最高標準的樣本需要使用更高的稀釋倍數重復。對于低于檢測范圍的樣本值，這些值被視為不可檢測。標準曲線范圍之外的值通常是非線性的，由于此特性，無法使用此曲線正確推斷出值。我們建議僅使用在檢測動態范圍內的樣本值。

  8.是否需要同時運行所有樣本？

  不是，因為大多數試劑盒都使用條狀微孔板，因此每次只能使用單個條狀微孔板，可用于在不同時間分析不同數量的樣品。

  9.每次都要進行空白和標準檢測嗎？

  是的，因為這些值是計算樣品濃度和再現性所必需的。這很重要，因為它可以反映出每次測定和每天的性能變化。

  10.是否需要運行重復樣本和標準？

  是的，這對于監測檢測的精確度很重要，并能提高檢測結果的可信度。我們建議至少進行重復實驗，但最好進行三次（或更多）。

  11.如何獲得可重復的結果？

  孵育時間、溫度、操作者、所用清洗和移液技術以及試劑盒使用年限的任何變化都可能導致產生許多差異。這些會直接影響所獲得的結果，因此強烈建議每個用戶都獲得自己的標準曲線。

  12.標準工作正常，但沒有樣品信號？

  這可能由多種原因造成。簡單的事實可能是樣品可能不包含您認為正在測試的分析物。未正確遵循建議的稀釋度，樣品過度稀釋可能導致其低于標準曲線的范圍，從而無法檢測到。也可能存在基質效應，這可能會掩蓋檢測。

  13.什么是樣品基質效應？

  大多數生物樣本由多種不同蛋白質和鹽的復雜混合物組成。眾所周知，這些溶解成分的存在會降低抗原和抗體的結合能力。這導致建立終點結合或平衡條件所需的時間大大增加。由于樣本中存在IgG的非特異性結合相互作用，也會產生假信號。樣本稀釋緩沖液的配方可用于降低與基質效應相關的測定背景噪音，并最大限度地減少IgG的非特異性結合，從而有助于優化測定信號。僅出于這個原因，許多樣本可能需要稀釋才能落入測定的功能范圍內。

  14.需要使用 ？

  強烈推薦這種方法，因為眾所周知，與使用振蕩器相比，獲得的OD值通常要低得多。

  15.建議按照哪些流程進行清洗步驟？

  手動和自動清洗程序都是可行的選擇。我們建議定期進行校準，并在清洗前沖洗系統。還必須小心吸干板子時使用的所有內容物和無絨紙。

  16.如果已經提取了樣本，建議的稀釋度是多少？

  在這種情況下，建議不要遵循試劑盒手冊中推薦的稀釋度，因為提取程序后所需的樣品稀釋量將受到提取和純化步驟的影響。濃縮或稀釋的量需要由最終用戶決定。

  17.波長校正是如何進行的？

  板讀取器必須設置為450nm，如果波長校正可用，則需要將其設置為540nm或570nm。此減法將糾正板中可能存在的任何光學缺陷。但是，如果讀取器中沒有此功能，則需要從450nm的讀數中減去540nm或570nm的讀數。進行雙波長讀數的主要原因是為了校正可能由塑料孔、燈或任何其他光學波動引起的光密度。如果僅直接在450nm下讀數而不進行任何校正，則可能導致獲得的結果更高且更不準確。

  18.造成背景信號過高的主要原因有哪些？

  主要原因是底物被污染，含有氧化劑或金屬離子。清洗不當是另一個眾所周知的原因，檢查清洗緩沖液儲液器的容量并嚴格遵循協議說明書中提到的推薦清洗程序至關重要。將底物暴露在光線下會導致底物變成其測量的藍色，這也會導致高背景信號。

  上述是紀寧為大家總結ELISA常見的問題，了解這些問題可以使自己再日后的實驗中提高實驗的效率。