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ELISA實(shí)驗(yàn)怎么操作?elisa實(shí)驗(yàn)步驟詳解

   ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ),將抗原抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高校催化作用相結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。根據(jù)檢測(cè)時(shí)標(biāo)本以及檢測(cè)目的等的不同具體可以設(shè)計(jì)出不同類型的ELISA方法,例如間接法、雙抗體夾心法和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。

 通蔚ELISA試劑盒

  實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

 

  先準(zhǔn)備好本次實(shí)驗(yàn)所需的各種試劑和耗材

 

  1.試劑:

 

  人TNF-αELISA試劑盒,包含:

 

  預(yù)包被抗人TNF-α單抗的96孔酶標(biāo)板

 

  凍干的人TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品

 

  樣品稀釋液

 

  生物素標(biāo)記的TNF-α抗體(或濃縮液,需自行稀釋)

 

  親和素-HRP(或濃縮液,需自行稀釋)

 

  TMB(POD)顯色底物

 

  終止液

 

  洗板液(濃縮液或即用型)

 

  2.耗材:

 

  1.5mL離心管

 

  QSP盒裝吸頭(10µL,100µL,1000µL等,根據(jù)需要選擇)

 

  冰盒

 

  ELISA蓋板膜

 

  3.儀器設(shè)備:

 

  單通道移液器(可根據(jù)需要添加多通道移液器)

 

  全波長(zhǎng)掃描多功能讀數(shù)儀(酶標(biāo)儀)

 

  渦旋振蕩器

 

  4.其他:

 

  量筒/燒杯

 

  吸水紙

 

  計(jì)時(shí)器

 

  實(shí)驗(yàn)操作

 

  樣品稀釋

 

  1.準(zhǔn)備稀釋液:將凍干的人TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品用適量超純水復(fù)溶,配制成濃度為2000pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品原液(或儲(chǔ)備液)。

 

  2.標(biāo)記離心管:取81.5毫升離心管做好濃度標(biāo)記,按照濃度從高到低依次排列,并標(biāo)明單位。假設(shè)你想要配置的是從1000pg/mL開(kāi)始,5倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品,那么8個(gè)離心管的濃度標(biāo)記應(yīng)該是:

 

  1000pg/mL

 

  200pg/mL

 

  40pg/mL

 

  8pg/mL

 

  1.6pg/mL

 

  0.32pg/mL

 

  0.064pg/mL

 

  0pg/mL(空白對(duì)照,通常用稀釋液代替)

 

  3.加入稀釋液:1000pg/mL0.064pg/mL7個(gè)離心管中,分別加入400µL稀釋液。在0pg/mL的空白對(duì)照管中加入900µL的稀釋液。

 

  4.配制1000pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品:吸取100µL2000pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品原液加入到含有400µL稀釋液的1000pg/mL離心管中,充分混勻。

 

  5.系列稀釋:1000pg/mL的離心管中吸取100µL,加入到200pg/mL的離心管中,充分混勻。更換新的槍頭。從200pg/mL的離心管中吸取100µL,加入到40pg/mL的離心管中,充分混勻。更換新的槍頭。以此類推,直到稀釋到0.064pg/mL。每次轉(zhuǎn)移都必須更換新的槍頭。

 

  6.空白對(duì)照:0pg/mL的離心管中不加標(biāo)準(zhǔn)品,只含有900µL的稀釋液。

 

  免疫反應(yīng)

 

  接下來(lái)進(jìn)入免疫反應(yīng)實(shí)驗(yàn),將所有試劑從冰箱中取出,平衡至室溫。

 

  按照50µL/孔的體積,將空白對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋后的待測(cè)樣品加入到酶標(biāo)板中。注意標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度依次加樣,并做好標(biāo)記。

 

  加樣完畢后,輕輕拍打酶標(biāo)板,使液體充分混勻。用封板膜封住酶標(biāo)板,室溫孵育1小時(shí)。孵育結(jié)束后,揭去封板膜,棄去孔內(nèi)液體,用洗板液洗滌酶標(biāo)板3次。

 

  按照100µL/孔的體積,加入按說(shuō)明書稀釋好的生物素標(biāo)記的TNF-α二抗,用封板膜封住酶標(biāo)板,室溫孵育1小時(shí)。孵育結(jié)束后,揭去封板膜,棄去孔內(nèi)液體,用洗板液洗滌酶標(biāo)板3次。

 

  按照100µL/孔的體積,加入按說(shuō)明書稀釋好的HRP,用封板膜封住酶標(biāo)板,室溫避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后,揭去封板膜,棄去孔內(nèi)液體,用洗板液洗滌酶標(biāo)板3次。

 

  按照100µL/孔的體積,加入TMB顯色底物,用封板膜封住酶標(biāo)板,室溫避光孵育30分鐘(具體時(shí)間請(qǐng)參考試劑盒說(shuō)明書)。

 

  加入終止液(例如硫酸或鹽酸)終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上,選擇合適的波長(zhǎng)(例如450nm,405nm490nm,請(qǐng)參考試劑盒說(shuō)明書)讀取各孔的OD值。

 

  最后大家可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析,因?yàn)槠邢蓿瑢?shí)驗(yàn)操作步驟分享到這里,上述實(shí)驗(yàn)步驟僅供參考。如果您對(duì)ELISA實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)一步了解,可以和紀(jì)寧生物在線顧問(wèn)尋求幫助!紀(jì)寧生物也提供代測(cè)服務(wù)。

 

  

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