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酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)原理及分類

  ELISA是最經(jīng)典的一種免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)操作,中文名字叫酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)。其原理就是利用抗體能和對(duì)應(yīng)的抗原蛋白分子特異結(jié)合,同時(shí)通過抗體上的酶聯(lián)標(biāo)記與底物反應(yīng)顯色或被激發(fā)而發(fā)光,最終間接完成抗原抗體復(fù)合物的觀察、檢測(cè)與定量。

ELISA原理

圖1 為elisa原理

  其實(shí)elisawesternblot很像,不同的是后者的待測(cè)物也就是蛋白質(zhì),通常是在細(xì)胞內(nèi),因此需要提取蛋白質(zhì)才能進(jìn)一步分離和檢測(cè);而elisa的待檢測(cè)物通常已經(jīng)從細(xì)胞內(nèi)分泌出來到培養(yǎng)液中,因此他的前處理步驟更簡(jiǎn)單。

圖2 比色法蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)示意圖

  幾種不同的elisa方法對(duì)比

  ELISA根據(jù)檢測(cè)方法分為好幾類,分別是直接法、間接法和夾心法。

  直接法就是待檢測(cè)抗原黏附在微孔板的孔內(nèi),然后使用帶酶標(biāo)的一抗與抗原結(jié)合,對(duì)吼加入底物進(jìn)行顯色,并檢測(cè)吸光度,由于吸光度的大小與抗原抗體復(fù)合物的數(shù)量成一定的線性關(guān)系,也就間接的實(shí)現(xiàn)了測(cè)定抗原數(shù)量的目標(biāo)。

  間接法和直接法的區(qū)別在于兩種抗體代替一種抗體,結(jié)合抗原的抗體(一抗)不帶酶標(biāo)記物,當(dāng)抗原抗體結(jié)合后再使用酶標(biāo)記的二抗結(jié)合一抗加入底物顯色并檢測(cè)。

  在間接法的基礎(chǔ)上,又再發(fā)展出更為復(fù)雜的夾心法,它在微孔板底部預(yù)先包被一種捕獲抗體,用于結(jié)合抗原,在這個(gè)復(fù)合物的基礎(chǔ)上再結(jié)合一抗、二抗并檢測(cè)。

  上述三種方法各有特點(diǎn),目前來看夾心法的ELISA應(yīng)用最普遍,下面這個(gè)表格總結(jié)不同方法特點(diǎn):


直接法 間接法、夾心法
優(yōu)點(diǎn)

操作簡(jiǎn)單
不存在抗原和二抗發(fā)生交叉反應(yīng)導(dǎo)致的結(jié)果錯(cuò)誤

二抗選擇面廣泛,制備也比較簡(jiǎn)單,大大降低陳本

酶標(biāo)種類也有更多選擇,一抗無需考慮標(biāo)記酶標(biāo)信息,所以它在制備中可以盡可能保證免疫結(jié)合活性

檢測(cè)靈敏度大大提高,因?yàn)樾盘?hào)得到放大

缺點(diǎn)

檢測(cè)抗體制備比較困難且成本高,因?yàn)榧纫WC免疫活性還要標(biāo)記酶標(biāo)信息

檢測(cè)信號(hào)無法放大,信號(hào)較弱

潛在的二抗與目標(biāo)抗原發(fā)生反應(yīng),造成信號(hào)錯(cuò)亂風(fēng)險(xiǎn)

更多操作步驟,反應(yīng)時(shí)間更長(zhǎng)


  接下來,我們繼續(xù)了解幾種比較特別的ELISA實(shí)驗(yàn)法,首先是競(jìng)爭(zhēng)法。如果待測(cè)抗原特別小,無法同時(shí)結(jié)合

  捕獲抗體和一抗的話,就不適合用夾心法檢測(cè),此時(shí)可以在微孔板孔內(nèi)包被抗體,同時(shí)提供帶標(biāo)記的同種抗原,把待測(cè)抗原和標(biāo)記抗原一起加入和抗體結(jié)合,由于兩者會(huì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體,所以最終檢測(cè)的信號(hào)越高,證明待檢測(cè)抗原越少,反之則越多。

  另一種比較特別的是叫elispot,用于檢測(cè)細(xì)胞分泌出來的蛋白和細(xì)胞因子。預(yù)先在孔內(nèi)包被捕獲抗體,加入未處理/預(yù)先處理的細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞分泌出特定蛋白或細(xì)胞因子時(shí),就會(huì)被抗體捕獲。細(xì)胞裂解后孔內(nèi)只剩下細(xì)胞因子與捕獲抗體的復(fù)合物,此時(shí)再加入能結(jié)合的細(xì)胞因子的帶生物素標(biāo)記的抗體。最終通過顯色形成的斑點(diǎn)來計(jì)算分泌蛋白的數(shù)量。

圖3 為elispot實(shí)驗(yàn)示意圖

  最后一種就是in-cellelise。這種檢測(cè)在細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行,細(xì)胞是正常生長(zhǎng)的,在孔內(nèi)加入一抗結(jié)合細(xì)胞表面的特異蛋白,然后通過酶標(biāo)二抗結(jié)合一抗后進(jìn)行觀察。二抗可以是熒光標(biāo)記也可以是酶聯(lián)標(biāo)記

  

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