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酶聯(lián)免疫吸附實驗原理及分類

  ELISA是最經(jīng)典的一種免疫學(xué)實驗操作,中文名字叫酶聯(lián)免疫吸附實驗。其原理就是利用抗體能和對應(yīng)的抗原蛋白分子特異結(jié)合,同時通過抗體上的酶聯(lián)標(biāo)記與底物反應(yīng)顯色或被激發(fā)而發(fā)光,最終間接完成抗原抗體復(fù)合物的觀察、檢測與定量。

ELISA原理

圖1 為elisa原理

  其實elisawesternblot很像,不同的是后者的待測物也就是蛋白質(zhì),通常是在細胞內(nèi),因此需要提取蛋白質(zhì)才能進一步分離和檢測;而elisa的待檢測物通常已經(jīng)從細胞內(nèi)分泌出來到培養(yǎng)液中,因此他的前處理步驟更簡單。

圖2 比色法蛋白質(zhì)印跡檢測示意圖

  幾種不同的elisa方法對比

  ELISA根據(jù)檢測方法分為好幾類,分別是直接法、間接法和夾心法。

  直接法就是待檢測抗原黏附在微孔板的孔內(nèi),然后使用帶酶標(biāo)的一抗與抗原結(jié)合,對吼加入底物進行顯色,并檢測吸光度,由于吸光度的大小與抗原抗體復(fù)合物的數(shù)量成一定的線性關(guān)系,也就間接的實現(xiàn)了測定抗原數(shù)量的目標(biāo)。

  間接法和直接法的區(qū)別在于兩種抗體代替一種抗體,結(jié)合抗原的抗體(一抗)不帶酶標(biāo)記物,當(dāng)抗原抗體結(jié)合后再使用酶標(biāo)記的二抗結(jié)合一抗加入底物顯色并檢測。

  在間接法的基礎(chǔ)上,又再發(fā)展出更為復(fù)雜的夾心法,它在微孔板底部預(yù)先包被一種捕獲抗體,用于結(jié)合抗原,在這個復(fù)合物的基礎(chǔ)上再結(jié)合一抗、二抗并檢測。

  上述三種方法各有特點,目前來看夾心法的ELISA應(yīng)用最普遍,下面這個表格總結(jié)不同方法特點:


直接法 間接法、夾心法
優(yōu)點

操作簡單
不存在抗原和二抗發(fā)生交叉反應(yīng)導(dǎo)致的結(jié)果錯誤

二抗選擇面廣泛,制備也比較簡單,大大降低陳本

酶標(biāo)種類也有更多選擇,一抗無需考慮標(biāo)記酶標(biāo)信息,所以它在制備中可以盡可能保證免疫結(jié)合活性

檢測靈敏度大大提高,因為信號得到放大

缺點

檢測抗體制備比較困難且成本高,因為既要保證免疫活性還要標(biāo)記酶標(biāo)信息

檢測信號無法放大,信號較弱

潛在的二抗與目標(biāo)抗原發(fā)生反應(yīng),造成信號錯亂風(fēng)險

更多操作步驟,反應(yīng)時間更長


  接下來,我們繼續(xù)了解幾種比較特別的ELISA實驗法,首先是競爭法。如果待測抗原特別小,無法同時結(jié)合

  捕獲抗體和一抗的話,就不適合用夾心法檢測,此時可以在微孔板孔內(nèi)包被抗體,同時提供帶標(biāo)記的同種抗原,把待測抗原和標(biāo)記抗原一起加入和抗體結(jié)合,由于兩者會競爭結(jié)合抗體,所以最終檢測的信號越高,證明待檢測抗原越少,反之則越多。

  另一種比較特別的是叫elispot,用于檢測細胞分泌出來的蛋白和細胞因子。預(yù)先在孔內(nèi)包被捕獲抗體,加入未處理/預(yù)先處理的細胞,當(dāng)細胞分泌出特定蛋白或細胞因子時,就會被抗體捕獲。細胞裂解后孔內(nèi)只剩下細胞因子與捕獲抗體的復(fù)合物,此時再加入能結(jié)合的細胞因子的帶生物素標(biāo)記的抗體。最終通過顯色形成的斑點來計算分泌蛋白的數(shù)量。

圖3 為elispot實驗示意圖

  最后一種就是in-cellelise。這種檢測在細胞培養(yǎng)板內(nèi)進行,細胞是正常生長的,在孔內(nèi)加入一抗結(jié)合細胞表面的特異蛋白,然后通過酶標(biāo)二抗結(jié)合一抗后進行觀察。二抗可以是熒光標(biāo)記也可以是酶聯(lián)標(biāo)記

  

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