聚合酶聯(lián)式反應(yīng)（PCR）是分子生物學(xué)用于創(chuàng)建特定DNA片斷的多個(gè)副本技術(shù)。該技術(shù)由美國生物學(xué)家KaryMullis于1983年開發(fā)。PCR使得生成一小段DNA的數(shù)百萬個(gè)副本可能。該工具通常用于生物分子學(xué)和生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室。

  PCR原理

  PCR技術(shù)基于DNA的酶促復(fù)制。在PCR中，使用引物介導(dǎo)的酶擴(kuò)增短片段DNA。DNA聚合酶 合成與模板DNA互補(bǔ)的新DNA鏈。DNA聚合酶只能將核苷酸添加到預(yù)先存在的3'-OH基團(tuán)上。因此，需要引物。因此，更多的核苷酸被添加到DNA聚合酶的3'引物端。

  PCR的組成部分

  PCR的組成部分如下：

  DNA模板——樣本中感興趣的DNA。

  DNA聚合酶–使用Taq聚合酶。它具有熱穩(wěn)定性，在極高溫度下也不會(huì)變性。

  寡核苷酸引物-這些是與正義鏈和反義鏈的3'端互補(bǔ)的短單鏈DNA。

  脫氧核糖核苷酸三磷酸–為聚合提供能量，是DNA合成的基石。它們是堿基的單一單位。

  緩沖系統(tǒng)–鎂和鉀為DNA變性和復(fù)性提供最佳條件。它對(duì)保真度、聚合酶活性和穩(wěn)定性也很重要。

  PCR類型

  PCR有以下類型：

  1.實(shí)時(shí)PCR

  在此類型中，DNA擴(kuò)增是借助熒光報(bào)告基因?qū)崟r(shí)檢測(cè)的。熒光報(bào)告基因的信號(hào)強(qiáng)度與擴(kuò)增的DNA分子數(shù)量成正比。

  2.嵌套PCR

  這是為了提高靈敏度和特異性。它們減少了由于意外引物結(jié)合位點(diǎn)擴(kuò)增而導(dǎo)致的產(chǎn)品非特異性結(jié)合。

  3.多重PCR

  它用于在單個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)。它可以同時(shí)擴(kuò)增許多不同的DNA序列。

  定量PCR

  它利用DNA擴(kuò)增線性來檢測(cè)、表征和量化樣本中的已知序列。

  4.任意引物PCR

  這是一種基于PCR的DNA指紋識(shí)別技術(shù)，使用任意選擇的DNA序列的引物。

  PCR步驟

  PCR涉及三個(gè)主要循環(huán)反應(yīng)：

  1.變性

  當(dāng)反應(yīng)混合物加熱至94℃并持續(xù)約0.5至2分鐘時(shí)，就會(huì)發(fā)生變性。這會(huì)破壞兩條DNA鏈之間的氫鍵，并將其轉(zhuǎn)化為單鏈DNA。

  單鏈現(xiàn)在充當(dāng)模板，用于產(chǎn)生新的DNA鏈。應(yīng)提供更長(zhǎng)時(shí)間的溫度，以確保兩條鏈分離。

  2.退火

  反應(yīng)溫度降至54-60℃，持續(xù)約20-40秒。此時(shí)引物與模板DNA上的互補(bǔ)序列結(jié)合。

  引物是長(zhǎng)度約為20至30個(gè)堿基的DNA或RNA單鏈序列。

  它們是DNA合成的起點(diǎn)。

  兩條分離的鏈以相反的方向運(yùn)行，因此有兩個(gè)引物——正向引物和反向引物。

  3.伸長(zhǎng)

  此步驟中，溫度升至72-80℃，利用Taq聚合酶將堿基添加到引物的3'端。

  這會(huì)使DNA從5'方向延伸至3'方向。DNA聚合酶在最佳條件下每分鐘增加約1000bp。

  Taq聚合酶可以耐受極高的溫度。它附著在引物上，并將DNA堿基添加到單鏈上。結(jié)果，獲得了雙鏈DNA分子。

重復(fù)這三個(gè)步驟20-40次，以便在很短的時(shí)間內(nèi)獲得大量感興趣的DNA序列。

上述是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）介紹，PCR在科研、醫(yī)學(xué)和藥品廣泛應(yīng)用，通過了解PCR及原理，用我們專業(yè)的PCR技術(shù)為科研貢獻(xiàn)一份力量。