逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）是一種分子技術。聚合酶聯式反應（PCR）是一種實驗方法，用于擴增DNA特定區域，以便在醫學研究中進行分析和診斷。RT-PCR使用mRNA作為起始模板，是PCR的改良版。其中使用一種稱為逆轉錄酶的酶。這種酶有助于將RNA序列轉化為其互補DNA序列。RT-PCR就是基于逆轉錄的原理。它是一種實時技術，結合了RNA逆轉錄成DNA和靶DNA擴增。它是一種定性檢測特定RNA序列的方法，具有很高的準確性和靈敏度。

  凱瑞·穆利斯(KarryMullis)發現了RT-PCR，以促進RNA檢測和量化。他因發明該技術并徹底改變了分子生物學領域而獲得了1993年諾貝爾化學獎。

  RT-PCR原理及步驟

  RT-PCR是一種分子診斷工具，其工作原理是利用逆轉錄酶將RNA模板轉化為互補DNA(cDNA)。然后，該cDNA通過PCR進行指數擴增，形成多個副本，然后用于下游分析。

  典型的PCR以DNA為模板，所用的酶為Taq聚合酶。然而，為了擴增RNA，需要進行逆轉錄，因為RNA不是Taq聚合酶的有效模板。因此，改良版PCR增加了一個額外的步驟，即先將RNA轉化為DNA，然后再進行PCR。

  首先，典型的RT-PCR檢測需要核酸、引物、逆轉錄酶、RNA樣本、DNA聚合酶和RT-PCR緩沖液。讓我們詳細了解一下RT-PCR過程：

  1.RNA分離完成后，提取RNA。

  2.將提取的RNA樣本加入到反應混合物中。反應混合物由核苷酸、逆轉錄酶和針對目標基因的特異性引物組成。

  3.如果目標存在，引物將與提取的RNA退火。

  4.逆轉錄酶發揮合成互補DNA（cDNA）鏈的功能。

  RNA/DNA雜交現在經歷PCR步驟：

  1.變性：在95oC時RNA/DNA鏈變性。

  2.退火：引物退火至新形成的cDNA

  3.延伸：從引物延伸，聚合酶通過復制合成新的DNA鏈。

  4.熱循環儀中的多次循環會增加PCR產物中DNA的拷貝數。

  此外，RT-PCR可以通過兩種不同的方式進行：

  一步法RT-PCR

  該方法中，逆轉錄和聚合酶鏈式反應的反應管是相同的，兩個過程同時進行。這種簡單方便的一步法適用于進行少量的檢測。由于兩個反應都在一個反應管中進行，因此使用的引物是序列特異性的。

  1.優點：

•   快速設置
•   處理時間更短
•   污染幾率極小
•   易于加工

  2.缺點：

•   單獨優化兩個反應存在局限性
•   不太敏感
•   為了分析新靶標或重復擴增，需要保存RNA等分試樣

  2步RT-PCR

  在該PCR反應中，RNA到cDNA的逆轉錄最初在40oC至50oC之間進行。隨后，所得的cDNA在單獨的反應中進行擴增-cDNA合成和PCR擴增是分離的。

  每一步使用的反應容器、緩沖液、試劑、條件和引發策略都不同。與一步RT-PCR不同，兩步RT-PCR使用隨機六聚體、基因特異性引物和寡聚dT引物的混合物。這允許獲得更高產量的cDNA，這些cDNA可以儲存或進一步擴增。

  這是一種高度敏感但耗時的方法。

  1.優點：

•   RT引物可供選擇
•   可以從單個RNA源擴增多個目標
•   即使起始材料有限也可以進行
•   反應優化靈活
•   逆轉錄酶和DNA聚合酶可單獨選擇，靈活性更高

  2.缺點：

•   更多的機器時間和設置
•   需要更多優化
•   增加污染的可能性

  RT-PCR應用

  RT-PCR可應用于：

1.   基因組測序
3.   檢測基因或染色體的變化
5.   基因表征
7.   基因表達和突變的研究
9.   RNA病毒研究
11.   白血病等疾病的診斷
13.   感染監測。

  RT-PCR在RNA病毒SARS-CoV-2的診斷中發揮了巨大作用。它成為檢測特定RNA序列的基準技術，正是由于這種靈敏的體外方法，冠狀病毒的大規模診斷才成為可能。